姜黄素对鼻咽癌细胞RECK基因甲基化以及MMP-9表达与活性的影响

王柏琦,陈艳华,蒋丽琴,程爱兰

(1.南华大学附属第二医院肿瘤内科,湖南衡阳421001;2.南华大学肿瘤研究所)

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)是我国南方地区最常见的恶性肿瘤之一,EB病毒感染、遗传因素、营养状况、年龄等均与本病的发生存在一定关联[1],但其发病机制目前仍不明了。近年来,DNA甲基化等表观遗传学的改变在肿瘤中的作用日益受到重视[2]。生理条件下,DNA甲基化是维持DNA稳定性以及DNA与蛋白质相互作用所必须[3]。然而DNA异常甲基化也可导致多种癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活。其中最常见的抑癌基因包括回复引导半胱氨酸丰富蛋白含kazal基元(Reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs,RECK)、Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)等,这些抑癌基因的失活与鼻咽癌的发生密切相关[4]。近年来研究显示,RECK蛋白可抑制机体基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)的水解从而抑制肿瘤细胞血管发生与转移[4]。

姜黄素是一种二酮类化合物,目前已经研究显示姜黄素对多种肿瘤细胞具有抑制作用[5]。但迄今为止,姜黄素能否影响鼻咽癌细胞中RECK基因的甲基化,目前仍不清楚。本研究拟从姜黄素入手,观察食源性物质能否影响鼻咽癌CNE-1细胞系中RECK基因的表达和甲基化,并观察其是否能影响MMP-9的活性而发挥抗肿瘤作用。

1 材料与方法

1.1 材料

姜黄素(纯度98%)为sigma产品。DNA提取试剂盒购自Qiagen,核蛋白提取试剂盒购自Pierce。抗MMP-9多克隆抗体购自Santa Cruz,HPR标记羊抗鼠IgG抗体购自北京中杉金桥生物有限公司。EpiQuik DNMT活性检测试剂盒购自Epigentek公司。其他分析纯产品主要购自上海生工生物工程公司。

1.2 细胞培养与MTT实验

CNE-1鼻咽癌细胞系购于ATCC,用含有10%FBS和1%青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基培养基中,于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。MTT法检测细胞的增殖活性。即100 μL细胞(约3×103)接种于96孔板中培养过夜,每组设3复孔。第二天换成含5% 胎牛血清和1%青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基,并加入不同浓度的姜黄素,继续培养72 h。结束前4 h各孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL),随后弃上清,并加入 200 μL DMSO,充分混匀,用酶标仪测定各孔的吸光度值(OD570),并计算抑制率。抑制率=(对照组OD值-实验室OD值)/对照组OD值×100%。

1.3 Western blot与甲基化活性分析

细胞处理完毕后,800 rpm离心5 min,弃上清,冰冷的PBS洗涤细胞两次。加入200 μL细胞裂解缓冲液重悬浮细胞(裂解液含蛋白酶抑制剂cocktail SetⅢ,1mM β-甘油磷酸酯、1 mmol/L 钒酸钠、1 mmol/L氟化钠,1 mmol/L苯甲磺酰基氟化物,20 mmol/L pH 7.0 HEPES、150 mmol/L NaCl,0.1%NP-40),冰上裂解40 min。1 000 rpm离心15 min后,获取上清。经5% ～15%SDS-PAGE后,Western blot检测 RECK或 MMP-9的表达。同时采用EpiQuikTMDNMT试剂盒检测CNE-1细胞核蛋白中的甲基化活性。

1.4 DNA提取和水解

获取1×107个姜黄素处理后的CNE-1细胞,按照Qiagen提供的试剂盒操作步骤提取基因组DNA用于全细胞甲基化分析。DNA根据参考文献提供的方法进行[6],即200 ng基因组DNA于100℃、3 min热处理变性,置于冰上冷却后加入1/10体积的醋酸铵(0.1 mol/L,pH 5.3)和2 U的核酸酶P1(Sigma),45℃孵育2 h后加入1/10体积的NH4HCO3(浓度1 mol/L)和0.002 U的毒液磷酸二酯酶I,37℃孵育1 h。随后加入0.5 U碱性磷酸酶,37℃培养1 h。

1.5 高效液相色谱-电喷雾质谱检测DNA甲基化

液相色谱包括HPLC系统(Agilent 1100型),色谱柱(Atlantis dC18柱,Waters),预柱(Waters)。流动相为0.1%甲酸-甲醇,流速为0.2 mL/min。电喷雾离子模式为正离子,扫描范围为m/z 100～2 000,离子源温度450℃,喷雾电压为415 kV,破簇电压为55 V,入口电压6V。碰撞能电压13 V,气帘气为138 kPa,气体1为221 kPa,气体2为379 kPa,碰撞气体为41 kPa[6]。采用Sciex Analyst software软件(版本1.3.1)处理数据。

1.6 Real-Time PCR分析

采用定量RT-PCR检测RECK和MMP-9的表达。细胞处理完毕,用Trizol试剂提取总RNA,取2 μg RNA用于 MMP-9 mRNA分析。反应条件:50℃2 min,95℃3 min,然后95℃15 s,60℃30 s,72℃ 30 s,共40个循环。反应在ABI prism 7700上进行。所得的数据与内参β-acin之比作为相对值。

1.7 明胶酶谱实验

姜黄素处理细胞后,获取25 μL培养上清用于聚丙烯酰胺凝胶电泳(含2 mg/mL明胶A和明胶B)。电泳结束后,卸下凝胶并将其置于Triton X-100(2.5%)的洗涤液中震荡洗涤以去除SDS。随后将凝胶放入100 mL孵育液中(100 mmol/L Tris,10 mmol/L CaCl2),37℃中孵育24 h,经0.5%考马斯亮蓝染色并脱色后,用凝胶成像系统拍照。

2 结 果

2.1 姜黄素增加CNE-1细胞RECK mRNA和蛋白表达

如图1所示,CNE-1细胞基础状态下RECK蛋白表达水平较低,而经10 μmol/L和30 μmol/L姜黄素处理后,细胞内RECK蛋白的表达显著增高(图1A)。与Western blot结果类似,real-time PCR结果显示,不同浓度的姜黄素也能增强其mRNA的表达,其趋势与蛋白表达一致(图1B)。

图1 姜黄素增加CNE-1细胞RECK蛋白和mRNA表达

2.2 姜黄素能降低RECK启动子区域以及全基因组以及细胞核DNA甲基化

高效液相色谱-电喷雾质谱结果显示,30 μmol/L姜黄素处理CNE-1细胞后,与对照组相比,RECK启动子甲基化水平降低为(69.04±10.62)%,全基因组甲基化水平降低为(61.13±7.08)%,CNE-1细胞核的甲基化活性降为2.8±1.31,见表 1。

表1 姜黄素对RECK启动子区域、全基因组以及细核DNA甲基化的影响

2.3 姜黄素能下调CNE-1细胞MMP-9的表达水平

Western blot结果显示,CNE-1细胞 MMP-9表达水平较高,1、10、30 μmol/L姜黄素处理细胞后,MMP-9蛋白水平显著降低(图2A)。Real-time PCR结果也显示其mRNA也随着姜黄素浓度的增高而逐渐降低(图2B)。

图2 姜黄素抑制CNE-1细胞MMP-9蛋白和mRNA表达

2.4 姜黄素对鼻咽癌细胞增殖及MMP-9酶活性的影响

CNE-1细胞在浓度为10、30 μmol/L姜黄素作用下的存活率分别为44%和23%。此外,明胶酶谱实验显示,姜黄素也能显著抑制其酶活性,随着姜黄素浓度的增高,酶活性逐渐降低(图3)。

3 讨 论

图3 姜黄素对鼻咽癌细胞增殖及MMP-9酶活性的影响

肿瘤从原发部位脱落并引起细胞外基质降解,是转移发生的关键步骤。在此过程中,MMPs发挥至关重要作用,其中以MMP-9最为重要[4,7]。RECK是调控MMP-9蛋白表达与活性的重要分子[8]。正常情况下,RECK基因广泛存在于机体各种组织细胞中,调控细胞的生长增殖等功能。但在各种恶性肿瘤细胞中,RECK蛋白往往呈低表达,且其基因中存在异常的甲基化,从而导致其功能减弱或消失,最终无法发挥对MMP-9的负调控作用而参与肿瘤的发生[9-10]。本研究证实,CNE-1细胞内RECK的mRNA和蛋白水平较低。经1～30 μmol/L姜黄素处理后,RECK基因mRNA和蛋白水平随姜黄素浓度的升高而增加。这表明姜黄素能有效上调鼻咽癌细胞中因甲基化而失活的RECK基因的表达。此外,CNE-1细胞中启动子、全基因组以及细胞核中甲基化RECK含量较高,而姜黄素处理后,甲基化水平显著降低。由于RECK基因甲基化后导致其对MMP-9的负调控功能减弱或消失,从而有利于肿瘤细胞从原发部位脱落并转移。姜黄素通过抑制其启动子区域甲基化,从而诱导RECK基因表达而重新获得对MMP-9的调控作用,这可能是其抗癌活性的一种新的分子机制[11]。

Western blot结果也证实,姜黄素能抑制CNE-1细胞中MMP-9的表达,并能在一定程度上降低其酶活性。鉴于MMP-9基因上游存在RECK的调控位点,因此姜黄素对MMP-9的抑制可能与上调RECK基因的表达有关。由于MMP-9是肿瘤细胞降解细胞外基质的重要分子,其表达水平和酶活性受到抑制后,无疑能降低肿瘤细胞从原发部位脱落和发生远处转移的能力[12]。

有研究显示,使用姜黄素处理鼻咽癌细胞后,能导致E-钙粘蛋白表达增高以及促进癌细胞凋亡,这与DNA甲基化酶抑制剂相似[13-14]。也有研究显示某些因超甲基化而沉默的抑癌基因,如GSTP1和MGMT,也能被姜黄素等去甲基化药物诱导而重新激活[15],这也从侧面证明了姜黄素对DNA甲基化具有抑制作用,并能重新激活失活的抑癌基因。目前,DNA去甲基化药物(如氮胞苷类药物)已经在临床上用于各种血液系统疾病的治疗并取得了一定的疗效[16-17]。由于姜黄素对DNA甲基化具有一定的抑制作用,因此有望为鼻咽癌的治疗提供一种新的辅助手段。姜黄素来源于天然植物,其毒性低[18]。此外,对于此氮胞苷类药物治疗无效的细胞,如干细胞,姜黄素可能具有更加广泛的应用价值。

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