DADS下调Cathepsin D抑制人胃癌MGC803细胞侵袭转移

殷耒兰,陈 琳,苏 菊,姜 浩,苏 琦,黄卫国,李跃华,唐三元

(1.湖南省胃癌研究中心南华大学附属第一医院肿瘤内科,湖南衡阳421001;2.南华大学医学院肿瘤研究所)

胃癌是全球第4位常见恶性肿瘤,每年大约有98.96万新发病例,73.8万人死于胃癌[1]。胃癌起病隐匿,早期常无特殊的明显症状,也无明显的体征,故发现时多数已发生淋巴结或远处转移,这是导致其预后差、死亡率高的主要原因。DADS在体内外抑制人胃癌MGC803细胞迁移和侵袭能力已有较多的实验依据,其机制可能与下调MMP-9、MMP-2、uPAR,上调 TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3,Rac1-Rock1/Pak1通路介导LIMK1下调,抑制cofilin1磷酸化[2-4]等有关。组织学研究发现组织蛋白酶D在胃癌组织中高表达,可能参与胃癌的侵袭转移[5],但DADS是否通过下调Cath-D的表达抑制人胃癌MGC803细胞侵袭转移尚未见报道。本实验进一步探讨DADS抑制人胃癌MGC803细胞迁移和侵袭的可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人胃癌MGC803细胞株、DADS由南华大学肿瘤研究所惠赠;胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司;LipofectamineTM2000、Trizol试剂购自美国 Invitrogen公司;siRNA由美国 Invitrogen公司设计合成(Cath-D siRNA 序列为:5′-GGATCCACCACAAGTACAA-3′、Control siRNA 序列为 5′-GGACCACAACAATGCTCAA-3′);RT试剂盒、PCR试剂盒购自加拿大Fermentas公司;鼠抗人Cath-D蛋白单克隆抗体购自美国Santa公司。

1.2 细胞培养和转染

人胃癌MGC803细胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中贴壁生长,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞进行转染,转染步骤按照说明书进行,siRNA终浓度为50 nmol/L。培养6 h后更换为含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基,转染后24 h收集细胞,作为后续检测。

1.3 RT-PCR检测Cathepsin D mRNA水平

设计并合成半定量RT-PCR引物。Cath-D正义链 5′-CAA CAG CGA CAA GTC CAG C-3′,反义链5′-CTG AAT CAG CGG CAC GGC-3′(597 bp);β-actin为内参照,5′-ATC TGG CAC CAC ACC T-3′,反义链 5′-CGT CAT ACT CCT GCT T-3′(837 bp)。使用Trizol提取细胞中总RNA,RNA逆转录成cDNA,再通过 PCR扩增。PCR条件为94℃变性5 min;36个PCR循环(94℃ 30 s,52℃ 30 s,72℃50 s);72℃ 5 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像仪观察、拍照并分析。

1.4 Western blot检测Cath-D蛋白水平

提取细胞总蛋白,蛋白定量,经电泳、转膜后,5%的脱脂奶粉室温封闭PVDF膜1 h;加入Cath-D、β-actin一抗,室温下摇动反应30 min后,置4℃冰箱过夜;TBST洗涤PVDF膜3次,每次10 min;加入相应二抗,室温下孵育60 min;TBST洗涤PVDF膜3次,每次10 min;加入ECL显影剂,置于凝胶成像仪内,结果用凝胶成像分析系统测量灰度值并分析。

1.5 划痕实验检测细胞迁移能力

细胞种于6孔板,转染24 h后,用200 μL Tip头在6孔板中沿着直尺划痕,PBS冲洗3次,需DADS处理的3组加入含有30 mg/L DADS的新鲜无血清培养基,另外3组加入新鲜无血清培养基,各组继续培养24 h,以各组划痕边缘细胞向划痕内部迁移的距离为观察指标,分别在0 h和24 h在倒置显微镜下拍照并记录,计算平均值与标准差,实验重复3次。

1.6 Transwell实验检测细胞侵袭能力

将Matrigel用无血清RPMI1640培养基稀释,每个小室上层均匀铺50 μL。制备单细胞悬液2×105/mL,下室加入500 μl含10%胎牛血清的1640培养基,取 100 μL单细胞悬液接种到上室,需DADS处理的3组在上室加入30 mg/L DADS,37℃、5%CO2恒温培养箱培养24 h,取出Transwell小室,4%多聚甲醛固定,0.1%结晶紫染色。显微镜观察,随机计数10个高倍视野侵袭至滤膜下表面的细胞数,计算平均值与标准差,实验重复3次。

1.7 统计学方法

数据采用SPSS13.0统计软件进行分析,数据以表示,组间区别用t检验分析,P＜0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 RT-PCR检测DADS及干扰Cath-D对人胃癌MGC803细胞Cath-D mRNA表达的影响

加DADS 3组的Cath-D mRNA表达水平均较未加DADS 3组明显下调(P＜0.05);Cath-D siRNA干扰组的Cath-D mRNA表达水平均明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05,图1);阴性对照组与未干扰组之间差异无统计学意义(P＞0.05,图1)。表明DADS能明显下调Cath-D mRNA表达水平。

2.2 Western blot检测DADS及干扰Cath-D对人胃癌MGC803细胞Cath-D蛋白表达的影响

图1 DADS及干扰Cath-D对MGC803细胞Cath-D mRNA表达的影响

加DADS 3组的Cath-D蛋白表达水平均较未加DADS 3组明显下调(P＜0.5);Cath-D siRNA干扰组的Cath-D蛋白表达水平均明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05,图2);阴性对照组与未干扰组之间差异无统计学意义(P＞0.05,图2)。表明DADS能明显下调Cath-D蛋白表达水平。

2.3 DADS及干扰Cath-D对MGC803细胞迁移能力的影响

从图3可见,各组在0 h时,划痕距离大体相同(P＞0.05,表1)。24 h后,加DADS 3组的划痕距离均较未加DADS 3组划痕距离明显增宽(P＜0.05);Cath-D siRNA干扰组较阴性对照组、未干扰组划痕距离明显增宽(P＜0.05,表1);阴性对照组与未干扰组之间差异无统计学意义(P＞0.05,表1)。

图2 DADS及干扰Cath-D对MGC803细胞Cath-D蛋白表达表达的影响

表1 各组不同时点划痕距离的比较(μm)

图3 DADS及干扰Cath-D对MGC803细胞迁移的影响(×100)

2.4 DADS及干扰Cath-D对MGC803细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验显示,加DADS 3组侵袭细胞数目均较未加DADS 3组穿膜细胞数明显减少(P＜0.05);Cath-D siRNA干扰组较阴性对照组、未干扰组侵袭细胞数目明显减少(P＜0.05,表2);阴性对照组与未干扰组之间差异无统计学意义(P＞0.05,图4,表2)。

图4 DADS及干扰Cath-D对MGC803细胞侵袭的影响(24 h,×200)

表2 干扰Cath-D与DADS联合对MGC803细胞侵袭(穿膜细胞数,个)的影响(24 h)

3 讨 论

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年有超过90万的人罹患胃癌并且有大约70万的人死于胃癌[6]。绝大部分胃癌患者就诊时已是晚期,5年生存率只有10%,这主要与胃癌侵袭和转移有关[7],所以明确其机制已成为研究的热点。

DADS是从大蒜中提取的一类脂溶性的有机硫化合物,对多种肿瘤具有明显的抑制作用[8],是一种很有开发潜力的抗肿瘤药物。DADS可抑制胃癌细胞生长,诱导胃癌细胞凋亡,其机制与G2/M阻滞,调节 ATR/Chk1/Cdc25C/cyclin B1通路,激活p38、JNK通路,抑制ERK通路,下调Cdc25C蛋白表达,上调 Caspase-3mRNA表达等有关[9-13]。DADS可诱导胃癌细胞分化,其机制可能与ERK1/2通路抑制[14],p21WAF1、pRb表达增强,突变型 p53、p21ras、c-Myc表达减弱,上调 RORα蛋白等有关[15]。本实验研究结果显示,DADS作用人胃癌MGC803细胞24 h后,加DADS 3组较未加DADS 3组Cath-D mRNA与蛋白表达水平明显下降,划痕距离明显增宽,穿膜细胞数明显减少,表明DADS能抑制人胃癌MGC803细胞的侵袭转移能力,其机制可能与下调Cath-D的表达有关。

Cath-D是存在于溶酶体内的一种可溶性的天门冬氨酸蛋白酶,在正常细胞中以低浓度存在,其功能是在溶酶体的酸性pH环境下分解蛋白质,参与细胞的生长调节[16-17]。研究发现,Cath-D过表达能促进肿瘤的恶性表型和转移能力,而在Cath-D基因敲除的裸鼠中发现,肿瘤的形成和肺转移瘤的发生和生长受到明显抑制,表明Cath-D与肿瘤的迁移和侵袭有一定的关系[18-19]。Ohri等[20]证实组织蛋白酶D前体能够促进乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移,这些效应的发挥主要与活性肽的27～44位氨基酸有关。Li等[5]证实胃癌组织中Cath-D的含量明显高于邻近的正常胃黏膜,并且Cath-D与胃癌淋巴结转移、分化程度以及预后密切相关。本实验利用siRNA干扰技术将Cath-D siRNA转染人胃癌MGC803细胞,研究结果显示,Cath-D siRNA下调Cath-D的mRNA与蛋白表达水平后,Cath-D siRNA干扰组较阴性对照组、未干扰组划痕距离明显增宽,侵袭细胞数目明显减少,表明Cath-D下调能明显抑制人胃癌MGC803细胞的侵袭转移能力,Cath-D表达水平与胃癌的侵袭转移能力相关。加入DADS后,Cath-D siRNA干扰组的Cath-D mRNA与蛋白表达水平下降最为明显,划痕距离最宽,穿膜细胞数最少,表明DADS可能通过下调Cath-D的表达抑制人胃癌MGC803细胞的侵袭转移。

综上所述,DADS能抑制人胃癌MGC803细胞的侵袭转移能力,其机制可能与下调Cath-D的表达有关。本研究为寻找抑制胃癌迁移和侵袭的作用靶点及药物提供了一定的实验依据。

[1] Siegel R,Ma J,Zou Z,et al.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2014,64(1):9-29.

[2] Park HS,Kim GY,Choi IW,et al.Inhibition of matrix metalloproteinase activities and tightening of tight junctions by diallyl disulfide in AGS human gastric carcinoma cells[J].J Food Sci,2011,76(4):T105-11.

[3] 谷彬燕,向姝霖,庄英帜,等.二烯丙基二硫抑制人胃癌SGC7901细胞侵袭及相关机制[J].中国药理学通报,2012,28(2):213-217.

[4] 马艳华,苏波,向姝霖,等.二烯丙基二硫下调LIMK1抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭[J].中国药理学通报,2012,28(12):1714-1718.

[5] Li Y,Liu N,Huang D,et al.Proteomic analysis on N,N′-dinitrosopiperazine-mediated metastasis of nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells[J].BMC Biochem,2012,13:25.

[6] Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[7] Catalano V,Labianca R,Beretta GD,et al.Gastric cancer[J].Crit Rev Oncol Hematol,2009,71(2):127-164.

[8] Yi L,Su Q.Molecular mechanisms for the anti-cancer effects of diallyl disulfide[J].Food and Chemical Toxicology,2013,57:362-370.

[9] Lee JE,Lee RA,Kim KH,et al.Induction of apoptosis with diallyl disulfide in AGS gastric cancer cell line[J].J Korean Surg Soc,2011,81(2):85-95.

[10] Ling H,Wen L,Ji XX,et al.Growth inhibitory effect and Chk1-dependent signaling involved in G2/M arrest on human gastric cancer cells induced by diallyl disulfide[J].Braz J Med Biol Res,2010,43(3):271-278.

[11] Yuan JP,Wang GH,Ling H,et al.Diallyl disulfide-induced G2/M arrest of human gastric cancer MGC803 cells involves activation of p38 MAP kinase pathways[J].World J Gastroenterol,2004,10(18):2731-2734.

[12] Wu XJ,Hu Y,Lamy E,et al.Apoptosis induction in human lung adenocarcinoma cells by oil-soluble allyl sulfides:triggers,pathways,and modulators[J].Environ Mol Mutagen,2009,50(3):266-275.

[13] 王菊岩,陈立军,刘舒颖,等.大蒜素对人胃癌MKN45细胞株的影响及其作用机制的研究[J].四川大学学报:医学版,2006,37(4):650-652.

[14] Ling H,Zhang LY,Su Q,et al.Erk is involved in the differentiation induced by diallyl disulfide in the human gastric cancer cell line MGC803[J].Cell Mol Biol Lett,2006,11(3):408-423.

[15] 石莺,黄建军,唐章文,等.二烯丙基二硫对人胃癌细胞RORα蛋白表达的影响[J].中国现代医学杂志,2012,(22)4:11-14.

[16] Dian D,Vrekoussis T,Shabani N,et al.Expression of cathepsin-D in primary breast cancer and corresponding local recurrence or metastasis:an immunohistochemical study[J].Anticancer Res,2012,32(3):901-905.

[17] Vashishta A,Ohri SS,Vetvicka V.Pleiotropic effects of cathepsin D[J].Endocr Metab Immune Disord Drug Targets,2009,9(4):385-391.

[18] Kirana C,Shi H,Laing E,et al.Cathepsin D expression in colorectal cancer:from proteomic discovery through validation using western blotting,immunohistochemistry,and tissue microarrays[J].Int J Proteomics,2012,2012:245819.

[19] Derocq D,Prébois C,Beaujouin M,et al.Cathepsin D is partly endocytosed by the LRP1 receptor and inhibits LRP1-regulated intramembrane proteolysis[J].Oncogene,2012,31(26):3202-3212.

[20] Ohri SS,Vashishta A,Proctor M,et al.The propeptide of cathepsin D increases proliferation,invasion and metastasis of breast cancer cells[J].Int J Oncol,2008,32(2):491-498.