一种用于快速检测奶牛乳房炎病原菌的鉴别培养基组合平板

孙虎芝，卢国民，任慧英

（青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛266109）

奶牛乳房炎是一种奶牛的多发病和常见病，是由多种致病微生物引起的局部病变，在奶牛养殖业中造成巨大经济损失。因此，加强对奶牛乳房炎的预防、诊断和治疗显得尤为重要。据报道，引起奶牛乳房炎的致病微生物共有100多种，分为接触类传染病原菌和环境病原菌两大类[1]。接触类病原菌包括无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌等；环境病原菌主要为大肠杆菌、酵母，以及疱疹病毒和口蹄疫病毒等[2]。细菌性病原常见金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌；化脓隐秘杆菌是一种小的，多形态的革兰阳性的条件致病杆菌[3]，可引起夏季牧场干奶期奶牛的“夏季乳房炎”，而且会在蝇的协助下发生“牛-牛传播”。此外，克雷伯氏菌菌属、产气杆菌属、大肠埃希菌属等细菌也可以引起发病。针对奶牛乳房炎的致病菌如何快速诊断尤为重要，这对及时治疗奶牛乳房炎起着关键作用。

由于奶牛乳房炎病原繁多，不同的微生物需要不同诊断方法，因此诊断方法多种多样。采用传统的细菌鉴定方法需要进行细菌的分离培养、形态检查及生化鉴定，鉴定程序繁琐且耗时长。PCR诊断技术快速，但是由于奶牛乳房炎的病原种类多，无法根据临床症状判断疑似病原，针对单一病原的PCR诊断方法存在很大的盲目性。

瑞典国家兽医研究所研制的鉴别培养基组合平板SELMA及SELMAPLUS，可用于临床奶牛乳房炎的快速诊断，并可对金黄色葡萄球菌进行耐药性检测。本文对SELMA系列平板进行介绍。

1 SELMA系列平板

SELMA平板有3个不同的检测区域，SELMA PLUS平板有4个不同的检测区域。每个区域含有不同的鉴别培养基，极大地方便了细菌性奶牛乳房炎的安全快速诊断。相应区域的平板背面进行了数字标记。在SELMA平板上，“1”为牛血液琼脂，含有七叶苷，所有的需氧性细菌可在此生长；“2”为麦康凯培养基，只有革兰阴性菌方可生长；“3”为甘露醇盐琼脂，葡萄球菌属及肠球菌属的细菌可在此生长。在上面生长的黄色菌落还可以用于检测葡萄球菌是否产生青霉素酶。在SELMA PLUS平板上，“1”及“2”同SELMA平板，“3”为PGUA琼脂（PGUA为4-硝基苯吡喃葡萄糖苷，为β-D-葡萄糖苷酶的底物），用于鉴定大肠杆菌，“4”为甘露醇盐琼脂，同SLEMA平板上的“3”。

2 SELMA系列平板适用的病料

SELMA和SELMA PLUS选择性培养基的成品均达到产品质量检测和产品品质保证的标准，用于奶牛乳房炎病原的培养及分类。大多数情况下，临床上急性的奶牛乳房炎由单一的细菌菌株引起，分离培养得到的菌落性状一致。从亚临床感染的奶牛乳房炎、黏膜、皮肤和伤口等处的样本往往可同时分离到多种细菌，这种情况下，SELMA系列的平板显然不适合进行细菌的培养和分类，因为SEMLA系列的平板上每种培养基仅占平板的1/3或1/4，这么小的区域很难区分单个菌落，而单个菌落的特征是鉴定细菌的重要依据，因此对于非牛奶样本，推荐使用单独的牛血液琼脂平板进行分离培养。

3 SELMA系列平板的使用方法

3.1 分离培养 SELMA系列平板的盖子内侧容易凝结冷凝水，使用前应轻轻打开平板。轻轻晃动装奶样的试管，用10μL取菌环取样后在每个区域上分别进行划线分离，按照数字的顺序接种，首先在牛血液琼脂上进行。为便于正确诊断，每个平板只接种一个奶样。接种后应尽快将平板进行37℃倒置培养18～48 h。培养18～24 h之后进行第一次观察，如果没有细菌生长，应继续培养24 h，以检查是否存在缓慢生长的细菌。

3.2 生长观察 检查平板上细菌的生长状况时，在反射光下可观察到细小的菌落，用半透明的光线可观察细菌的溶血性。如果牛血液琼脂上没有细菌生长或者有少量生长，说明奶样中细菌量极少，没有必要进行进一步的细菌学检测。

3.3 不同细菌的鉴别 所有的有氧细菌能够在牛血液琼脂上生长。链球菌只在牛血液琼脂上生长。葡萄球菌和肠球菌在牛血液琼脂和甘露醇盐琼脂上生长。革兰阴性菌在牛血液琼脂、麦康凯培养基和PGUA琼脂上生长。甘露醇盐琼脂用于区别金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌；麦康凯培养基用于鉴别革兰阴性菌；PGUA琼脂用于区分大肠杆菌和克雷伯氏菌属的细菌。

3.3.1 革兰阳性菌 （1）葡萄球菌属：葡萄球菌属的细菌可分为金黄色葡萄球菌（为凝固酶阳性）和凝固酶阴性葡萄球菌，均可在牛血液琼脂和甘露醇盐琼脂上生长。金黄色葡萄球菌的典型特点是在牛血液琼脂上形成双层溶血环，而凝固酶阴性葡萄球菌没有此现象。围绕金黄色葡萄球菌菌落内层的溶血环透明，外层溶血环不透明。在甘露醇盐琼脂上，金黄色葡萄球菌因为能利用甘露醇，故其菌落周围的培养基变成黄色，而凝固酶阴性葡萄球菌菌落周围通常没有这种颜色变化。葡萄球菌属的细菌易产生青霉素酶导致出现耐药性。青霉素酶又称β-内酰胺酶，可水解β-内酰胺类抗生素，包括青霉素G；氨基青霉素类，如氨苄西林、阿莫西林、匹氨西林；羧基青霉素类，如羧苄西林、替卡西林等；及脲基青霉素类，如呋苄西林、美洛西林等。因此，在SELMA系列平板上分离到葡萄球菌的基础上，进行青霉素酶试验可直接评价细菌的耐药性，为临床治疗奶牛乳房炎提供依据。金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌均应进行青霉素酶产生试验，方法如下。

当观察到甘露醇盐琼脂上菌落周围的琼脂变黄后，将头孢噻吩药敏纸片贴放于黄色的菌落上。将平板置37℃孵育15～20min，如果纸片颜色由粉红色变为深红色则说明该菌株产生青霉素酶。药敏纸片颜色观察最好从平板背面进行。有的时候，纸片的颜色变化不完整，只有菌落贴到纸片上的位置才会出现小红点。需要注意的是，青霉素酶试验只能在仅含有一种菌落的情况下采用。该试验不能在牛血液琼脂上进行，也不能在葡萄球菌属以外的细菌菌落上进行，因为其他菌属的细菌也会使甘露醇盐琼脂变黄。

如果甘露醇盐琼脂上的菌落没有变黄，即为凝固酶阴性葡萄球菌，那么青霉素酶的产生试验需要在载玻片上做。将头孢噻吩药敏纸片放于载玻片上，用微量的无菌蒸馏水或生理盐水湿润，然后用接种环从牛血液琼脂上挑取菌落涂抹到药敏纸片上，放在37℃的环境下孵育，在15～30min内观察纸片的颜色变化，纸片从粉红色变为深红色说明细菌产生青霉素酶，重要的是孵育的全过程需要在湿润的条件下进行，因此通常将其放在空的培养皿里。

（2）链球菌属：大多数情况下，所有的链球菌都能够在18～24 h内在牛血液琼脂上形成可见菌落。β-溶血性链球菌，例如无乳链球菌，常在菌落周围形成透明的溶血环[5]。α-溶血性链球菌，例如停乳链球菌，在菌落周围形成草绿色的溶血环。乳房链球菌也可以形成草绿色溶血环，故不能与其他链球菌区分开来。肠球菌有时可以在甘露醇盐琼脂上形成小的菌落并且使培养基变黄。但是，链球菌的菌落普遍比较细小，从形态上容易与肠球菌区别。

（3）化脓隐秘杆菌：化脓隐秘杆菌经过18～24 h的培养，在反射光下勉强可见针尖大小的菌落。在半透明条件下可能会观察到微弱的不透明溶血环。继续培养24 h后，菌落更易于观察，小的溶血环更加清晰。

3.3.2 革兰阴性菌 大肠菌群在培养4～6 h后就可在牛血液琼脂和麦康凯培养基形成小菌落。只有大肠杆菌和克雷伯氏菌属的细菌会在麦康凯培养基上形成紫红色的菌落。溶血性大肠杆菌在牛血液琼脂上产生透明的溶血环。克雷伯氏菌属的细菌比大肠杆菌的菌落更黏稠，当用接种环挑取菌落时，常产生菌落的拉丝现象。

大肠杆菌和克雷伯氏菌属的细菌在SELMA PLUS平板上很容易区分。大肠杆菌在PGUA琼脂上会使菌落周围的琼脂变成黄绿色。当PGUA琼脂上有大量的大肠杆菌生长时，整个PGUA琼脂都变为黄绿色，少量大肠杆菌生长时，只有菌落周围才变色。在PGUA琼脂上生长的克雷伯氏菌属的细菌则不会引起培养基的颜色变化。

假单胞菌属在牛血液琼脂、麦康凯培养基和PGUA琼脂上可形成具有典型焦糖味的灰绿色发光的菌落，这一点与其他细菌相比具有典型的鉴别意义。奇异变形杆菌常在牛血液琼脂上进行弥漫生长，而在其他的区域上则可见单个菌落，且不引起培养基颜色变化。

3.3.3 其他细菌 除上述的细菌外，尚有多种细菌可引起奶牛乳房炎，例如芽孢杆菌属和肠杆菌科的某些菌种。芽孢杆菌的菌落相对较大而且边缘不整齐，通常具有溶血作用，有时可能会在甘露醇盐琼脂上生长。酵母通常在牛血液琼脂上生长，但有时经过48 h培养之后也会在甘露醇盐琼脂上生长。牛棒状杆菌通常被认为是不致病的，常从乳房炎样本中分离到。经过48 h培养后会在牛血液琼脂上形成不溶血、干燥的白色菌落。

各种奶牛乳房炎病原的鉴别见表1。

表1 各种奶牛乳房炎病原的鉴别

4 其他说明

SELMA系列平板由瑞典国家兽医研究所研制。SELMA和SELMA PLUS平板倒置冷藏的保存期为2个月。青霉素酶试验所用的头孢噻吩纸片的保存期为1年。如果无法通过SELMA系列平板判定检测结果，应将平板或牛奶样本送往兽医细菌学实验室进行进一步的检测。对分离到的细菌进行药敏试验，可有效指导临床用药。SELMA系列平板方便了奶牛乳房炎的快速、便捷的准确诊断。

[1]甘露.奶牛乳房炎病原菌PCR快速鉴定及牛源地衣芽孢杆菌感染小鼠乳房炎模型的研究[D].芜湖：安徽师范大学，2012.

[2]剧慧栋.奶牛乳房炎主要致病菌的相关研究[D].石家庄：河北师范大学，2012.

[3]赵敬翠，李杰，刘耀川，等.化脓隐秘杆菌的特性及化脓隐秘杆菌病的防治[J].黑龙江畜牧兽医，2009，11：92-93.

[4]陈海儿，陈群英，张慧萍.无乳链球菌213株标本分布及耐药性分析[J].中国药物与临床，2013，02：252-254.

[5]Bengt Ekberg.SELMA，SELMA PLUS[EB/OL].http：//www.sva.se/en/Service-and-products/Substrate production/SELMA-and-SELMA-PLUS，2011-09-15/2013-11-22.