多拉菌素浇泼剂对小鼠免疫功能影响的试验

高玉红，宋铭忻

（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030；2.黑龙江职业学院，黑龙江 哈尔滨150080）

1993年，美国辉瑞（Pfizer）公司研发人员利用突变的阿维链霉菌研制合成了更新一代的优秀的大环内酯类抗寄生虫药物-多拉菌素（Doramectin）[1]。这种新研制的多拉菌素是阿维菌素的第二代产品，其合成的机理是在阿维菌素的第25位C上引入一环己烷基而形成的[2]，多拉菌素与阿维菌素相比其优越性在于消除率低，血药浓度维持时间较长，生物半衰期比较长，生物利用率比阿维菌素更高[1-3]。

多拉菌素被认为是目前阿维菌素族中最优秀的内外兼杀抗寄生虫药物之一，对体内外线虫以及体外的节肢动物均有良好的驱杀作用[4]。有研究结果表明，5mg/kg体重对小鼠的消化道线虫具有良好的驱杀效果[5]。

以往多拉菌素的剂型多以注射剂为主，但是由于药物的自身特点，如水溶性不佳，在多拉菌素注射剂的生产过程中会添加助溶剂等刺激性比较强的有机溶剂，在临床应用过程中会对动物造成一定程度的刺激性[6]，且费时费力，使饲养成本相对增加。基于此种原因，东北农业大学动物医学学院寄生虫教研室自行开发研制出了更加便于应用的多拉菌素的新剂型-多拉菌素浇泼剂。此种剂型具有操作更加简易、疗效十分确切、对动物机体的刺激性非常小等优点。延长药物对寄生虫的作用时间和增强药物的疗效[7]。前期研究结果表明，多拉菌素浇泼剂对家兔无任何毒性反应，对豚鼠皮肤无刺激性反应，不产生致敏作用[8]。对小鼠无致畸性，无遗传毒性作用[9]。为了进一步检测多拉菌素浇泼剂应用的安全性，进行了免疫学方面的相关试验。

1 试验材料

1.1 试验动物 清洁级健康昆明系小鼠175只，雌雄各半，体重18～22 g，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.2 试验试剂与仪器

主要试剂：多拉菌素浇泼剂，由东北农业大学动物医学学院寄生虫教研室自行研制；FITC Rat Anti-Mouse CD4，Bioledend公 司；PE Rat Anti-Mouse CD8a，Bioledend公司；环磷酰胺（Cyclophos⁃phamide，Cy）New Jersey USA：1-800-ACROS-01；免疫球蛋白IgG、IgM、IgA试剂盒，购自三维公司。

主要仪器：FACSAria流式细胞仪（美国BD公司）BD FACSDiva Software；全自动生化分析仪（D240V）天津神州英诺华医疗科技有限公司；大容量低温高速离心机HITACHIRXⅡSeries。

2 试验方法

将175只小鼠随机分成5组：对照组（C组）：该组不用药，每只小鼠皮肤浇泼等体积的溶剂；环磷酰胺组（Cy组）：剂量80mg/kg体重，按0.02mL/g腹腔注射4 mg/mL生理盐水Cy溶液；低剂量组（L组）：该组每只小鼠经皮给药多拉菌素浇泼剂5 mg/kg体重；中剂量组（M组）：该组每只小鼠经皮给药多拉菌素浇泼剂15mg/kg体重；高剂量组（H组）：该组每只小鼠经皮给药多拉菌素浇泼剂30 mg/kg体重。C组、CY组、L组、M组、H组各组于给药后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、45 d分别每组取5只小鼠，每只取血液200μL用于检测小鼠血液CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比例变化，200μL常规方法分离血清，用于检测血清中的抗体IgG、IgM、IgA的变化。

2.1 流式细胞仪检测小鼠外周血液CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的变化 取200μL小鼠血液于肝素抗凝管中，每个样各取抗凝血100μL于2mLEP管中，并且再分别取100μL加入一个EP管中混匀，从混合血液中取100μL分别加入3个EP管中，作为阴性、CD4+单染、CD8+单染；加入CD4+、CD8+抗体，使血液中CD4+抗体终浓度1∶200，CD8+抗体终浓度1∶100。阴性对照不加抗体，CD4+单染只加CD4+抗体，CD8+单染只加CD8+抗体；把各管避光放入4℃、15min使相应的淋巴细胞与抗体结合；取出后每管各加入0.5mL溶血素，避光放入30℃水浴中，30min；取出各管加入PBS1～1.5mL，850 r/min（4℃）离心10min，弃上清，每管加0.5mL 1%甲醛PBS重悬，加完轻轻吹打3～4次，避光置于冰块中待流式细胞仪检测。整个过程应尽量避免剧烈操作，以免造成对细胞的损伤。

2.2 全自动生化分析仪检测血清中IgG、IgA、IgM的变化 全自动生化分析仪检测血清中的抗体IgG、IgM、IgA的变化。参数设定参照试剂说明书进行。

3 结果分析与评价

3.1 多拉菌素浇泼剂对小鼠外周血CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的影响 C组、Cy组、L组、M组、H组于给药后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、45 d分别取小鼠外周血液，将淋巴细胞经特异性单克隆荧光抗体标记后，在流式细胞仪上能够根据细胞大小获得区域明显的淋巴细胞团。经BDFACSDiva Software分析处理，并采用二维点阵图形式表示。结果见图1～3。

图1 多拉菌素浇泼剂对小鼠血液CD4+百分数的影响

图2 多拉菌素浇泼剂对小鼠血液CD8+百分数的影响

流式细胞仪检测外周血液CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的变化，检测结果如1～3图所示：

Cy组CD4+细胞百分数极显著低于C组（P＜0.01），L组和和M组CD4+百分数在第14到21日显著高于C组（P＜0.05），其他时间点虽然高于C组，但未见统计学差异（P＞0.05）。L组和M组之间CD4+百分数未见统计学差异。H组CD4+百分数低于C组，但未见统计学差异（P＞0.05）。Cy组CD8+细胞百分数显著低于C组（P＜0.05），L组、M组、H组的CD8+淋巴细胞百分数和C组比较均未见显著性差异（P＞0.05）。Cy组在各个时间点CD4+/CD8+均低于C组，L组和M组CD4+/CD8+高于C组，H组CD4+/CD8+低于C组。

图3 多拉菌素浇泼剂对小鼠血液CD4+/CD8+的影响

3.2 多拉菌素浇泼剂对小鼠血清中IgA、IgG、IgM的影响 常规方法分离血清，全自动生化分析仪检测血清中的抗体IgG、IgM、IgA的变化。参数设定参照试剂说明书进行，结果如图4～6所示。

图4 多拉菌素浇泼剂对小鼠血清I gG的影响

图5 多拉菌素浇泼剂对小鼠血清I gM的影响

小鼠血清中的IgG含量在各个时间点Cy组均极显著低于C组（P＜0.01），L组、M组与C之间差异不显著（P＞0.05），H组低于C组，但未见统计学差异（P＞0.05）。IgM、IgA与IgG检测结果相同。

4 讨论

图6 多拉菌素浇泼剂对小鼠血清I gA的影响

T细胞按其表面表达CD分子的不同，分为CD4+T细胞和CD8+T细胞两大亚群，所有T细胞表型均为CD3+T细胞[10]。通常情况下，正常机体内CD4+T细胞数量高于CD8+T细胞的数量，二者的比值一般保持较为稳定的平衡状态。李锋等认为正常小鼠的CD4+/CD8+的比值大约为1.6，这与本试验测得正常小鼠的CD4+/CD8+的比值较为接近。由于机体在受到多种环境因素刺激时，外周血T细胞亚群也会发生相应的变化，从而使机体的免疫功能发生变化。CD4+/CD8+的比值上升，通常提示机体的免疫功能有所升高[11]。

本试验研究结果发现，Cy组CD4+细胞百分数极显著低于C组（P＜0.01），由环磷酰胺所导致的免疫抑制小鼠外周血中CD4+/CD8+的比值明显下降，结果证实，环磷酰胺可以抑制小鼠的免疫功能，免疫抑制小鼠模型建造成功。L组和M组CD4+百分数在第14和21日显著高于C组（P＜0.05），其他时间点虽然高于C组，但未见统计学差异（P＞0.05）。L组和M组之间CD4+百分数未见统计学差异。H组CD4+百分数低于C组，但未见统计学差异（P＞0.05）。CD8+淋巴细胞百分比的变化：Cy组和C组差异显著（P＜0.05），其他各组的CD8+淋巴细胞百分数和C组相比均未见显著性差异（P＞0.05）。可以认为，多拉菌素浇泼剂对机体特异性细胞免疫功能的改善作用，主要是通过调节血液中辅助性CD4+T细胞的数量和CD4+/CD8+细胞的比值来实现对小鼠特异性细胞免疫功能的调节作用。具体机理有待于进一步研究。Cy组在各个时间点CD4+/CD8+均低于C组，L组和M组CD4+/CD8+高于C组，H组CD4+/CD8+低于C组。

说明合适剂量的多拉菌素可以调节小鼠外周血液CD4+T细胞和CD4+/CD8+比值变化。此结果可以看出，合适剂量的多拉菌素浇泼剂可以朝着有利于改善小鼠免疫功能的方向发展。合适剂量多拉菌素浇泼剂作用后，小鼠特异性细胞免疫功能出现增强现象，那么多拉菌素浇泼剂引发的这种现象是通过何种机制实现的？多拉菌素浇泼剂是通过何种途径发挥作用的？以上问题有待于进一步研究。

体液免疫是特异性免疫的重要组成部分，在抗感染免疫中与细胞免疫相辅相成，共同发挥免疫作用。B淋巴细胞是体内唯一能产生抗体免疫球蛋白分子的细胞，成熟的B淋巴细胞可分泌抗体（主要为IgG、IgM、IgA等）发挥体液免疫功能。因此，体内IgG、IgM、IgA水平可反映机体的体液免疫功能。本实验研究结果表明，低、中、高剂量时，IgG、IgM、IgA与对照组比较无明显差异（P＞0.05），高剂量时，IgG、IgM、IgA虽然低于对照组，但未见统计学差异（P＞0.05），说明多拉菌素浇泼剂对小鼠体液免疫功能无显著性影响，推测多拉菌素浇泼剂对小鼠免疫功能的影响是以细胞免疫为主，其作用机制还有待于进一步研究。

5 结论

多拉菌素浇泼剂在低、中、高3个剂量组时，均可以改变外周血液CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量，且有一定的剂量-效应关系，表明合适剂量的多拉菌素浇泼剂可以朝着有利于改善小鼠特异性细胞免疫功能的方向发展。

低、中剂量时，IgA、IgM、IgG无明显变化，高剂量时，IgA、IgM、IgG有所降低，但和C组相比无统计学差异，说明多拉菌素浇泼剂各剂量时对小鼠体液免疫均无显著影响。推测多拉菌素浇泼剂对小鼠免疫功能的影响是以细胞免疫为主，具体机制还有待于进一步研究。

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