人尿激肽原酶对脑缺血再灌注大鼠缺血灶TGF-β1 表达的影响

李国前，王杰华，杨小霞，潘 莹，陈淑增，许秀秀

缺血性脑血管病是严重危害人类健康的多发病和常见病，其发生、发展分子机制的研究和防治措施，一直是神经科学研究的热点［1］。研究发现有多种细胞因子和炎性介质参与介导，减轻或加重缺血性脑损伤。转化生长因子-β1(transforming growth factor，TGF-β1)在急性脑血管的病理生理过程中发挥重要作用，它的表达和生成对保护和修复缺血性脑损伤具有重要意义。人尿激肽原酶(human urinary kallidinogenase)是近年研制治疗脑梗死I 类新药，研究表明应用人尿激肽原酶可以减少脑缺血损伤面积，减轻神经功能损伤［2］，但其具体作用机制尚未得以解决。本研究在建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型基础上给予人尿激肽原酶进行干预，探讨人尿激肽原酶对TGF-β1 表达的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 成年雄性SD 大鼠24 只，体重250～300 g，福建医科大学实验动物中心提供。人尿激肽原酶(0.15 PNA 单位/瓶)，广东天普生化医药股份有限公司;Trizol 试剂，Invitrogen 公司;逆转录试剂盒及PCR 试剂盒，MBI Fermentas 公司;兔抗大鼠TGF-β1 抗体，武汉博士德生物工程有限公司;即用型免疫组化试剂盒(鼠/兔)，福州迈新生物技术开发有限公司;β-actin 和辣根酶标记IgG，北京中杉金桥生物技术有限公司;Beyo ECL，Western 荧光检测试剂，碧云天生物技术公司。

1.2 动物分组与给药 实验大鼠随机分为3组:对照组(sham 组)、缺血再灌注组(model 组)和用药组(test 组)，每组8 只。用药组于再灌注后5 min 静脉注射用灭菌生理氯化钠溶液稀释的人尿激肽原酶3.5×10-3PNAU/kg，给药体积1 ml/kg。对照组和缺血再灌注组正常喂养。

1.3 模型制备 缺血再灌注组和用药组参考改良Zea-Longa 线栓法［3］制备大鼠大脑中动脉栓塞模型。血流阻断2 h 后拔出线栓，形成再灌注。对照组大鼠接受相似手术处理，但是不插入线栓。再灌注48 h 后处死动物断头取脑，取右侧大脑半球视交叉后6～11 mm 的缺血侧脑组织皮质区备用。

1.4 半定量PCR 法检测TGF-β1 mRNA 的表达 TGF-β1 上游引物为:5’-gaatacagggctttcgcttcag-3’，下游引物为:5’-gttggttgtagagggcaaggac-3’(扩增产物399 bp);β-actin 上游引物为:5’-accgtgaaaagatgacccagat-3’，下游引物为:5’-agctgtggtggtgaagctgtag-3’(扩增产物269 bp)。取缺血侧脑组织按Trizol 法提取总RNA 并进行逆转录反应。PCR 扩增反应条件为:变性94 ℃30 s，退火64 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，反应循环数为34。反应完毕后扩增产物进行电泳，半定量分析电泳条带的吸光度，结果以目的基因与β-actin 吸光度的比值表示。

1.5 免疫组织化学法检测TGF-β1 的表达大鼠脑组织切片经脱腊至水，严格按照试剂盒说明书操作，AEC 室温显色，自来水冲洗，苏木素复染，水性封片剂封片。阴性对照用PBS 代替一抗。阳性细胞计数:在400 倍光学显微镜下分别随机选取5 个视野，分别计数免疫反应阳性的细胞数后取平均值。

1.6 Western blot 法检测TGF-β1 蛋白的表达 取缺血侧脑组织100 mg 严格按照说明书进行蛋白提取，采用BCA 法测定蛋白浓度。蛋白变性后垂直电泳、转膜封闭，分别加入一抗(兔抗大鼠TGF-β1抗体，1∶1000;兔抗大鼠β-actin 抗体，1∶1000)，4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶2000)室温孵育，ECL 液显色，X 片显影、定影。采用Image J 图像分析测定Western blot 条带灰度值，结果以TGF-β1 与β-actin 灰度值的比值表示。

1.7 数据统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件进行单因素方差分析，结果用均数±标准差(±s)表示，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF-β1 mRNA 的表达变化 对照组TGFβ1 mRNA 有微弱的表达(0.12±0.03)。缺血再灌注组TGF-β1 mRNA 表达较对照组显著增高(0.38±0.05)，差异有统计学意义(P＜0.05)。用药组TGFβ1 mRNA 表达较缺血再灌注组显著增高(0.65±0.08)，差异有统计学意义(P＜0.05)(见表1、图1)。

2.2 TGF-β1 阳性细胞的表达变化 对照组仅见少量TGF-β1 阳性细胞表达(9.57±2.07)。缺血再灌注组TGF-β1 阳性细胞表达较对照组显著增多(29.20±4.56)，差异有统计学意义(P＜0.05)。用药组TGF-β1 阳性细胞表达较缺血再灌注组显著增多(38.26±6.70)，差异有统计学意义(P＜0.05)(见表1、图2)。

2.3 TGF-β1 蛋白的表达变化 对照组TGFβ1 蛋白有微弱的表达(0.21±0.04)。缺血再灌注组TGF-β1 蛋白表达较对照组显著增多(0.32±0.05)，差异有统计学意义(P＜0.05)。用药组TGF-β1 蛋白表达较缺血再灌注组显著增多(0.75±0.08)，差异有统计学意义(P＜0.05)(见表1、图3)。

表1 各组大鼠TGF-β1 表达的比较(n=8，±s)

表1 各组大鼠TGF-β1 表达的比较(n=8，±s)

与对照组比较* P＜0.05;与缺血再灌注组比较#P＜0.05

图1 各组大鼠缺血区脑组织TGF-β1 mRNA 的表达

图2 各组大鼠缺血区脑组织TGF-β1 阳性细胞的表达(×400)

图3 各组大鼠缺血区脑组织TGF-β1 蛋白的表达

3 讨论

转化生长因子-β1(TGF-β1)是一种分子量为25 kD 的多功能细胞因子，几乎所有类型的细胞均可合成TGF-β1 并表达相应的受体。TGF-β1 的作用涉及细胞生长、分化、炎症和组织修复;而在脑缺血性损伤中TGF-β1 具有抗氧化、组织细胞凋亡、调节炎症反应、调节小胶质细胞和星形细胞反应的多种作用［4］。中枢神经系统神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞都可表达TGF-β1。在生理情况下，TGFβ1 呈低水平表达;但缺血缺氧时TGF-β1 的表达明显增加。Krupinski 等［5］对人缺血性卒中后脑组织中TGF-β1 表达进行研究，结果显示所有神经细胞、胶质细胞，尤其是少突胶质细胞均有TGF-β1 的表达，且缺血区表达强而半影区更强。本实验结果提示，大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血周边区TGF-β1 mRNA 和蛋白的表达均明显升高。脑缺血损伤中TGF-β1 表达的增加可能是缺血缺氧损伤诱导神经细胞和神经胶质细胞应激所致。研究发现脑室注射TGF-β1 能挽救短暂性全脑缺血后海马CA1区锥体神经元损害。缺血区TGF-β1 增加的可能作用如下:(1)促进微血管生成:TGF-β1 作为强有力的血管生成调节因子，可以激活缺血半暗带区的内皮细胞，促进微血管增生;(2)减弱脑缺血诱发的血管反应:TGF-β1 能弱化由于脑缺血缺氧引起的局部血压过低和高碳酸血症所诱发的脑血管扩张;(3)削弱细胞内Ca2+超载触发的一系列瀑布式反应，抗细胞凋亡;(4)拮抗谷氨酸盐和NO 的神经毒性物质，减轻神经细胞损伤［6，7］。

人尿激肽原酶是近年来研制出的一种治疗脑梗死的I 类新药，是从人尿液中提取精制的糖蛋白［8］。国内外研究显示人尿激肽原酶作用靶点明确，通过激肽原酶-激肽系统起作用。激肽原酶-激肽系统是机体重要的调节系统，广泛存在于许多组织和器官中。当缺血性脑损伤发生后，人尿激肽原酶作用于激肽原的特定位点，产生的激肽与激肽受体结合后，从而发挥选择性扩张缺血脑组织的微动脉，加强新生血管的形成和促进侧枝循环，改善局部脑血流量，改善脑组织的葡萄糖和氧的摄取，加快神经功能缺损的恢复和缩小脑梗死范围的作用［9，10］。我们的前期实验亦证实，对脑缺血再灌注损伤大鼠早期应用人尿激肽原酶进行干预，可抑制神经细胞的凋亡进程，减少神经功能缺损，发挥神经保护作用［11］。本实验从另一个角度进一步研究发现，脑缺血再灌注损伤予人尿激肽原酶干预后，脑缺血周边区TGF-β1的表达进一步升高，说明人尿激肽原酶可促进脑缺血区TGF-β1 的表达增加，从而加强脑保护作用。

［1］任占川，李瑞梅，杨迎春，等.高血脂对大鼠脑缺血再灌注损伤后海马内bFGF 表达的影响［J］.神经解剖学杂志，2013，29(4):440-444.

［2］Emanueli C，Madeddu P.Angiogenesis therapy with human tissue kallikrein for the treatment of ischemic diseases［J］.Arch Mal Coeur Vaiss，2004，97:679-687.

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91.

［4］薛慎伍，刘春寒，张兆岩，等.依达拉奉对慢性脑缺血鼠TGF-β1和Bcl-2 表达的影响［J］.实用医药杂志，2009，26(5):43-45.

［5］Krupinski J，Kumar P，Kumar S，et al.Increased expression of TGFβ1 in brain tissue after ischemic stroke in human［J］.Stroke，1996，27(5):852-857.

［6］夏加琴，倪白云，张险平，等.亚低温对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血灶TGF-β1 表达的影响［J］.皖南医学院学报，2011，30(1):4-7.

［7］Amstead WM.Transforming growth factor beta attenuates ischemia-induced alterations in cerebrovascular responses［J］.Am J Physian，1993，264(2):381-382.

［8］李晓莉，侯永敏.治疗急性脑梗死新药-凯力康［J］.中国处方药，2005，11(44):69-72.

［9］王夏红，何文龙，赵建民.尤瑞克林治疗进展性脑梗死的疗效观察［J/CD］.中华脑血管病杂志，2010，4(5):367-370.

［10］刘平平，苏赐力，王燕宏.尤瑞克林治疗急性期脑梗死的疗效及血清CRP 的变化［J］.中国实用医刊，2013，40(5):11-12.

［11］李国前，王杰华，杨小霞，等.尤瑞克林对大鼠脑缺血再灌注损伤Bcl-2 和Bax 表达的影响［J］.中华老年医学杂志，2011，30(9):770-773.