实验性大鼠脑出血COX-2 与MAP-2 表达及作用

宋福勤，刘玉艳，王 博，赵瑞波

脑出血是发病率较高的脑血管疾病，近年来人们对脑出血后血肿周围区越来越关注，由于这个区域存在早期的可干预性，成为对脑出血患者进行治疗的方向。COX-2 是催化花生四烯酸生成前列腺的限速酶，是炎症导致细胞毒性的关键因子，各种损伤因素(如IL-1、IL-6、IL-8、TNF)可诱导COX-2 表达。MAP-2 是横越在细胞核和细胞质膜内侧面的一种纤维状蛋白基质，对细胞生命活动是必要的。本试验通过对COX-2 和MAP2 在脑出血后的表达，探讨实验性大鼠脑出血后脑组织COX-2 和MAP-2 两者之间的关系和意义，及其对脑组织神经元损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 Wistar 大鼠84 只，雌雄不拘，体重200～300 g，由白求恩医科大学动物实验中心提供，许可证号:(吉)2003-001，随机分为出血组和正常组。出血组分为自体血组和盐水对照组，自体血组按不同时间分为3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d、14 d、28 d、10 个亚组，每组7 只;盐水组为6 h 组7 只;正常对照组7 只。以标准饲料和纯净水喂养，术前、术后大鼠自由饮水进食。

1.1.2 主要仪器与试剂 ST-3ND 型脑立体定位仪、微量进样器(上海激光医学仪器厂);羊抗鼠COX-2多克隆抗体、兔抗鼠MAP-2 多克隆抗体(武汉博士德生物制剂有限公司);光学显微镜(日本OLYMPUS)。

1.2 方法

1.2.1 脑出血模型的建立 大鼠给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)，随后俯卧位固定于大鼠脑立体定位仪上。常规备皮消毒，沿头皮正中切开一长约10 mm 的纵切口，切开骨膜，钝性分离暴露前囟。调整立体定位仪，将微量注射仪尖端定位于前囟前0.5 mm、中线右侧旁3 mm。用微型手钻在此钻一直径0.5 mm 的小孔。取大鼠尾部上1/3 段，刮除角质鳞片后消毒，用微量注射仪抽取大鼠尾动脉血50 μl。迅速将注射仪装入立体定位仪上，并沿所钻小孔进针6 mm(相当于大鼠尾状核部位)，按20 μl/min 的速度缓慢匀速注入尾状核。注血结束后，留针5 min，缓慢退针，小孔用骨蜡封闭，缝合切口皮肤。盐水组注入同体积的生理盐水。术毕将大鼠放回笼中，自由活动进食，在注射完毕后6 h 时处死大鼠并取脑。

1.2.2 神经功能缺损评分 大鼠处死前参照Zea Longa［1］的5 分制方法进行神经功能缺损评(0～4):0 分，无神经功能缺损症状;1 分，对侧前爪不能伸直;2 分，行走时向患侧偏转;3 分，向患侧倾倒;4 分，不能行走，意识障碍。0 分和4 分动物弃掉，1～3 分为实验成功。

1.2.3 组织切片的制备 各组大鼠在相应的时间点用过量的水合氯醛麻醉，直接断头取脑，脑组织标本浸于10%福尔马林液中固定72 h，出血组以针眼为中心取厚约5 mm 的冠状切片，石蜡包埋，最后切片。

1.2.4 COX-2 和MAP-2 蛋白表达的测定 采用免疫组化SP 法，具体操作按试剂盒说明书进行。围绕出血灶周围取6 个不重复高倍镜视野，计数每高倍视野(400×)下阳性细胞数。

2 结果

2.1 形态学观察 在脑出血早期，血肿周围脑组织轻度水肿，局部可见少量单个散在炎性细胞浸润，神经毡溶解，灶周神经元明显改变。脑出血后期出血灶缩小，胶质瘢痕修复，胶质细胞增生，多量含铁血黄素沉积，脑水肿变轻。

2.2 COX-2 和MAP2 免疫组化检测和结果2.2.1 COX-2 和MAP2 随时间变化的趋势对照组很少见COX-2 阳性表达的细胞，且散在于鼠大脑皮质神经元，出血3 h 即增加，与对照组差异有统计学意义(P＜0.05)。COX-2 主要在血肿周围的神经元表达，而出血灶中心无表达，3 d 时最明显，皮质中细胞形态完整的神经元可见阳性表达，而在血肿中心COX-2 表达甚微，5 d 开始下降，并持续到中期。脑出血组各时间点COX-2 表达均高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。对照组有大量的MAP-2 阳性细胞，可见细胞轮廓清晰，排列整齐，突起较长且连续。脑出血后血肿中心及周边MAP-2 表达紊乱且减少，之后稍有改善，但和对照组大鼠比较，表达仍较少。出血后3 h，血肿周围区MAP-2 阳性细胞开始减少，与对照组差异有统计学意义(P＜0.05);突起断裂不连续或弯曲变形，排列紊乱;有的神经元呈球拍样，个别神经元消失。脑出血3 d，紧邻血肿周围区MAP-2 阳性细胞大量消失，突起断裂呈碎点状或消失，仅胞浆呈阳性染色。5 d 后虽有所增加但与对照组的差异有统计学意义。对照组与出血3 h～14 d 组之间差异具有统计学意义(P＜0.05)(见表1)。

2.2.2 COX-2 与MAP-2 的关系 脑出血3 h开始COX-2 表达升高，3 d 达高峰，以后逐渐下降。MAP-2 于出血3 h 开始下降，3 d 达到最低点，以后有所增加，对照组与出血组之间的关系有统计学意义(P＜0.05)。脑出血组COX-2 与MAP-2 表达相关分析显示，脑出血组COX-2 表达与MAP-2 表达之间呈负相关(r=-0.902)。

表1 大鼠脑出血后不同时间点COX-2、MAP-2 蛋白表达

3 讨论

脑出血后血液由破裂的血管进入脑实质，通过占位效应及机械性破坏，脑水肿、脑缺血、炎症及细胞凋亡等造成继发性损伤，使神经元发生一系列的病理变化［2］。本实验模型显示，注血后大鼠活动明显减少，反应较术前迟钝，部分动物可见注血对侧肢体活动不灵活，有单方向转圈、追尾现象，同侧瞳孔缩小，严重者肢体完全偏瘫而无法活动。大体病理显示尾壳核区类圆形血肿者被视为模型制作成功。少数大鼠在注血后死亡，考虑与个体差异、麻药过量有关。诱导型环氧合酶(cyclooxygenase-2，COX-2)是催化花生四烯酸生成前列腺的限速酶，是炎症导致细胞毒性的关键因子。各种损伤因素(如IL-1、IL-6、IL-8、TNF)可诱导COX-2 表达，生成前列腺素及各种炎症介质，引起炎症反应。在神经系统，COX-2 与自由基的毒性作用及一氧化氮介导的神经损伤等因素密切相关［3］。脑组织出现炎症反应时，可引起局部脑血流下降，诱导细胞因子(NF-κB ICAM-1、TNF-α、IL-6)的基因表达及蛋白产物如金属蛋白酶(MMPs)的生成，激活并趋化炎症细胞向损伤区游走、浸润，并释放多种酶和炎症介质，加重局部组织水肿和神经细胞损害［4］。通过对COX-2基因缺陷鼠的研究发现，其抗中枢神经损伤的能力增强，提示COX-2 在脑损伤中起重要作用［5］。在实验性大鼠脑出血模型中，COX-2 表达在3 h 后明显增高，3 d 达最明显，但其作用机制尚不明确。近来研究显示，COX-2 在神经系统疾病中起重要作用。

脑出血后3 h COX-2 表达增加提示其代谢产物PG 和TXA2(前列腺素A2)产生增加［6］。TXA2 是一种很强的缩血管和促血栓形成因子，可增加脑微循环阻力，通过收缩血管加重局部脑缺血，引起血管通透性变化，神经细胞水肿，加重神经元损害。它可促进脑血管痉挛和微血栓形成，其结果是CBF 下降，出血后脑损伤加重［7］。另外，COX-2 还可通过对NO 通路的调节诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA 表达，增加氧自由基NO 的产生［8］。以上机制均可引起出血后血肿周围神经细胞的持续损伤，神经细胞结构和功能破坏，导致继发性神经细胞死亡。

细胞骨架是横越在细胞核和细胞质膜内侧面的一种纤维状蛋白基质，对细胞生命活动是必要的。MAP-2［9］作为细胞骨架的主要成员之一，是一种调节微管蛋白组装的重要调节因子，在维持微管动力学稳定等方面发挥重要作用［10］。研究发现，MAP-2免疫活性下降可造成微管性堆积、影响细胞骨架的完整，最终导致神经元死亡。MAP-2 广泛分布于神经元突起部分，呈条索状，胞体内也有少量表达。脑出血后3 h，血肿周围区MAP-2 阳性细胞开始减少，与对照组差异有统计学意义(P＜0.05)，突起断裂不连续或弯曲变形，排列紊乱，有的神经元呈球拍样，个别神经元消失［11］。脑出血3 h 以后，紧邻血肿周围区MAP-2 阳性细胞大量消失。3 d 后虽有所增加但与对照组的差异仍有统计学意义(P＜0.05)，对照组与3 h～14 d 组之间差异具有统计学意义(P＜0.05)。研究表明脑损伤后各种原因所致的细胞内钙超载，可激活钙依赖性过程，导致MAP-2异常磷酸化、抑制微管聚合、促进微管分解、导致细胞骨架变形甚至崩解等一系列组织病理改变及行为缺失［12］。因此，MAP-2 结构损伤及功能障碍势必导致神经元形态及功能异常。

本实验显示，脑出血3 h 后，COX-2 即明显升高，MAP-2 较正常明显下降，出血3 dCOX-2 达最高值，MAP-2 在此时达最低，以后COX-2 表达下降，MAP-2 表达增加。脑出血后，由于血肿释放的各种炎性介质，如IL-1、IL-6、IL-8、TNF，可诱导COX-2 在神经系统表达，COX-2 与自由基的毒性作用及一氧化氮介导的神经损伤等因素密切相关。脑组织出现炎症反应时，可引起局部脑血流下降，诱导细胞因子(NF-κB、ICAM-1、TNF-α、IL-6)的基因表达及蛋白产物如金属蛋白酶(MMPs)的生成，激活并趋化炎症细胞向损伤区游走、浸润，并释放多种酶和炎症介质等。各种原因所致的细胞内钙超载激活钙依赖性过程、导致MAP-2 异常磷酸化、水解细胞骨架崩解、导致不可逆的神经元损伤［13］、抑制微管聚合、促进微管分解、导致细胞骨架变形甚至崩解等一系列组织病理改变及行为缺失。MAP-2 在神经元内的高水平表达和与树突及胞体的选择性结合及其对细胞骨架成分的调节作用均支持MAP-2 作为神经元形态学调节因子的作用。因此，MAP-2 结构损伤及功能障碍势必导致神经元形态及功能异常。脑出血后组织形态学改变可能与细胞骨架的崩解有关。因而我们推测MAP-2 的分解破坏或合成障碍可能参与了脑出血继发性损伤，其原因可能与脑出血后高浓度的COX-2 有关，其机制有待于进一步探讨。

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