丁苯酞预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑水肿和血脑屏障的影响

纪海茹，孔令伟，孔 维，赵淑敏，孔祥玉，陈 萌，郑小影

在时间窗内对缺血性脑血管疾病进行溶栓是治疗脑卒中的主要措施，然而此举导致的脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)所引发的炎症反应及自由基毒性等因素，致使血脑屏障(blood brain barrier，BBB)通透性增加和脑水肿的发生［1］。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)可降解细胞外基质，破坏BBB 的结构，与脑水肿的发生关系密切，在CIRI 后表达显著增加。基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)是MMP-9 的特异性抑制剂，可间接反映MMP-9 表达水平［2］。

丁苯酞(3-n-butylphthalide)软胶囊，商品名恩必普(NBP)，可通过多个环节改善病灶局部循环，减轻脑组织损伤，对缺血性脑卒中疗效显著，已是目前治疗脑梗死的首选药物［3］。但其预防性应用的报道很少，机制也尚不明了，本研究将其预处理于CIRI大鼠，探讨其预防性的保护作用及机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组 健康雄性SD 大鼠90只，体重260～280 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。随机分为假手术组(Sham 组)、模型组(IR 组)、NBP 低剂量组(NBPⅠ组)、NBP 中剂量组(NBPⅡ组)、NBP 高剂量组(NBP Ⅲ组)，每组18只。

1.2 动物模型制备及处理 大鼠经适应性喂养后，灌胃给药，NBPⅠ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别给予NBP 20、40、80mg/kg-1/d-1，假手术组和模型组给等容积的生理盐水，共7 d。模型组及给药组采用Zea Longa［4］改良线栓法制备大鼠MCAO 模型，假手术组仅分离右侧颈总、颈外、颈内动脉，不插入线栓。术后单笼饲养，电暖气保暖。缺血2 h 后抽提栓线至颈外动脉残端内进行再灌注，再灌注24 h 后做相应处理。

1.3 脑水肿程度测定 采用干湿重法检测脑组织含水量。各组取6 只大鼠麻醉后迅速断头取脑，分离出右侧大脑，用电子天平称其湿重后，置于100 ℃烤箱中烤干至恒重。脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.4 BBB 通透性测定 采用伊文思蓝(Evans blue，EB)示踪法监测血脑屏障损伤程度。每组6 只大鼠处死前1 h，经尾静脉注入2%的EB(4 ml)，大鼠球结膜、四肢等处变蓝表示注入成功。循环1 h后，经心脏灌注预冷的生理盐水至右心房流出清亮液体时，快速断头取脑，取缺血侧脑组织称湿重后放入5 ml 甲酰胺溶液中浸泡，54 ℃恒温培养箱中孵育24 h，1000 r/min 离心5 min，测其630 nm 处的OD值。甲酰胺溶液做空白比色。脑组织EB 含量(μg/g)=待测样品EB 含量(μg/ml)×甲酰胺容量(ml)/脑湿重(g)，待测样品EB 含量根据标准曲线求得。

1.5 实时荧光定量PCR 法检测MMP-9、TIMP-1 mRNA 表达水平 每组6 只大鼠取缺血侧脑皮质提取总RNA，紫外分光光度计检验RNA 纯度，要求波长在260/280 处吸光度比值为1.8～2.2。根据GenBank 上登录的MMP-9、TIMP-1 的基因序列，以β-actin 为内参照，设计合成引物。各引物的序列分别为:MMP-9 上游引物:5’-CGCTGACAAGAAGTGGGGTTT-3’，下游引物:5’-TACAGATGGTGGATGCCTTTTATG-3’;TIMP-1 上游引物:5’-CCTGGTTCCCTGGCATAATC-3’，下游引物:5’-CGCTCTGGTAGCCCTTCTC-3’;β-actin 上游引物:5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物:5 ’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3 ’。根 据Takara 公司提供的实时荧光定量试剂盒采用SYBR法对MMP-9、TIMP-1 mRNA 的表达水平进行测定，总反应体系为25 μl，包括Premix Ex TaqⅡ12.5 μl、cDNA 2 μl、灭菌蒸馏水8.5 μl、上下游引物各1 μl(10 μmol)，放入实时定量PCR 反应仪，反应条件:预变性95 ℃30 s，变性95 ℃5 s，退火51 ℃(MMP-9)或48 ℃(TIMP-1)30 s，延伸72 ℃30 s，反应循环数为40，设置熔解曲线判断是否有非特异性的扩增和引物二聚体的出现。分析利用2-△△Ct的方法。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0 软件进行统计学分析，数据均以均数±标准差(±s)表示，不同组间均数比较用One-way ANOVO 检验，各组间两两比较采用SNK q 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NBP 预处理对脑水肿程度的影响 与Sham 组比较，IR 组与NBP 预处理各组脑含水量显著增加(P＜0.01);与IR 组比较，NBP 预处理各组脑含水量均显著减少(P＜0.01)，NBPⅡ、Ⅲ组较NBPⅠ组减少更明显(P＜0.05)，但NBPⅡ、Ⅲ组之间差异并不明显(P＞0.05)(见表1)。

2.2 NBP 预处理对脑组织BBB 通透性的影响与Sham 组比较，IR 组与NBP 预处理各组脑内EB 含量均显著增加(P＜0.01);与IR 组比较，NBP各组脑内EB 含量均显著降低(P＜0.01)，NBPⅡ、Ⅲ组较NBPⅠ组降低更多(P＜0.05)，但NBPⅡ、Ⅲ组之间差异不明显(P＞0.05)(见表2)。

2.3 NBP 预处理对脑组织MMP-9 和TIMP-1 mRNA 表达的影响 结果显示，Sham 组大鼠脑组织内MMP-9 和TIMP-1 均有微量表达;IR 组大鼠脑组织内MMP-9 的表达与正常组比较明显升高，TIMP-1也相应升高(P＜0.01);NBP 预处理各组MMP-9 表达均减少(P＜0.01)，TIMP-1 表达均增加(P＜0.01)，其中NBPⅡ组较NBPⅠ组减少明显(P＜0.05)，NBP Ⅲ组与NBPⅡ组无显著性差异(P＞0.05)(见表3)。

表1 各组脑含水量的比较(±s)

表1 各组脑含水量的比较(±s)

与Sham 组比较* P＜0.01;与IR 组比较#P＜0.01;与低剂量组比较△P＜0.05

表2 各组脑内EB 含量的比较(±s)

表2 各组脑内EB 含量的比较(±s)

与Sham 组比较* P＜0.01;与IR 组比较#P＜0.01;与低剂量组比较△P＜0.05

表3 各组脑组织MMP-9、TIMP-1 mRNA相对表达量的比较(±s)

表3 各组脑组织MMP-9、TIMP-1 mRNA相对表达量的比较(±s)

与Sham 组比较* P＜0.01;与IR 组比较#P＜0.01;与低剂量组比较△P＜0.05

3 讨论

血管源性脑水肿是CIRI 的常见并发症，也是引起脑疝的主要病因，其机制是BBB 通透性增高，引起毛细血管内血浆蛋白和水分外溢，使脑组织细胞外液含量增加［5］。MMP-9 由血管内皮细胞、小胶质细胞和中性粒细胞等合成并分泌，在正常组织内以酶原形式存在，表达量低，在缺血缺氧等情况下被激活表达量大幅增加，可水解细胞外基质，开放BBB，引起血管源性脑水肿［6，7］。敲除MMP-9 基因或给予抑制剂，可减轻脑水肿［8］。TIMP-1 与MMP-9 特异性结合进而抑制其活性，阻断其对细胞外基质和基底膜的降解，二者表达情况与脑含水量变化一致，参与了BBB的破坏［9］。本实验结果表明，CIRI 后MMP-9 表达明显增多，TIMP-1 表达显著减少，EB 含量和脑含水量均增加，与文献报道一致［10］。

恩必普是我国拥有自主知识产权的国家一类新药，可作用于脑缺血病理的多个环节，是目前治疗脑梗死的首选药物［11］，但对其预防作用的研究较少。本实验将其预防性应用于CIRI 大鼠，结果显示:丁苯酞预处理后可下调MMP-9 的表达，上调TIMP-1的表达，降低BBB 通透性，减少脑含水量。NBPⅡ、Ⅲ组脑水肿和BBB 损伤的程度较NBPⅠ组明显减轻，而二者之间差异并不显著，可见260～280 g 大鼠的最佳预防剂量为40 mg/kg-1。综上所述，丁苯酞对脑缺血再灌注损伤的预防性保护作用，可能是通过调整MMP-9 和TIMP-1 的表达，减轻血脑屏障的损伤，降低脑水肿程度。这一结果提示，丁苯酞可预防性应用于脑卒中的高危人群，对缺血性脑损伤疾病的防治有重要意义。

［1］Jin G，Arai K，Murata Y，et al.Protecting against cerebrovascular injury:contributions of 12/15-lipoxygenase to edema formation after transient focal ischemia［J］.Stroke，2008，39(9):2538-2543.

［2］李 青，白宏英，曾志磊，等.乌司他丁对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障通透性和MMP-9 活性的影响［J］.中风与神经疾病杂志，2011，28(2):123-125.

［3］纪海茹，孔 维，赵淑敏，等.丁苯酞对脑缺血再灌注损伤保护作用的研究进展［J］.承德医学院学报，2014，31(3):250-252.

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91.

［5］Guo W，Feng G，Miao Y，et al.Rapamycin alleviates brain edema after focal cerebral ischemia reperfusion in rats［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，2014，36(3):211-223.

［6］Wu Y，Wang YP，Guo P，et al.A lipoxin A4 analog ameliorates blood-brain barrier dysfunction and reduces MMP-9 expression in a rat model of focal cerebral ischemia-reperfusion injury［J］.J Mol Neurosci，2012，46(3):483-491.

［7］Xiang J，Lan R，Tang YP，et al.Apocynum venetum leaf extract attenuates disruption of the blood brain barrier and upregulation of matrix metalloproteinase-9/-2 in a rat model of cerebral ischemia-reperfusion injury［J］.Neurochem Res，2012，37(8):1820-1828.

［8］Zhao BQ，Wang S，Kim HY，et al.Role of matrix metalloproteinases in delayed cortical responses after stroke［J］.Nat Med，2006，12(4):441-445.

［9］Krizanac-Bengez L，Hossain M，Fazio V，et al.Loss of flow induces leukocyte-mediated MMP/TIMP imbalance in dynamic in vitro blood brain barrier model role of pro-inflammatory cytokines［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2006，291(4):740-749.

［10］高 兰，娄季宇，杨霄鹏.丁苯酞对脑缺血再灌注损伤大鼠MMP-9 活性和血脑屏障通透性的影响［J］.中风与神经疾病杂志，2012，29(2):116-118.

［11］李延可，刘 宁，陈江君.丁苯酞对急性缺血性脑卒中的作用及机制研究［J］.中国医药导刊，2012，14(2):254-255.