缝隙连接抑制剂辛醇对大鼠局灶性脑梗死后MDA 和SOD 的双向作用

曾维勇，丁文婷，邱 敏，刘 微

缺血性脑血管疾病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是对人体健康具有严重危害性的多发病与常见病。ICVD 的损伤机制涉及到兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载、细胞凋亡等。其中，位于星型胶质细胞膜上的缝隙连接(gap junction，GJ)是细胞间物质与信息传递的通路，在脑缺血中半暗带(ischemic penumbra，IP)向梗死灶的发展过程中有双向作用［1～3］，但其双向作用机制尚不明确。

有研究指出，缝隙连接抑制剂辛醇对局灶性脑缺血再灌注损伤存在双向作用，且可能与脑缺血时间有关［4，5］。制作局灶性脑缺血再灌注模型前给予辛醇抑制缝隙连接，通过检测不同程度脑缺血脑组织中过氧化物歧化酶(SOD)与丙二醛(MDA)的含量，来探讨论证缝隙连接抑制剂辛醇在脑缺血中的双向作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料 清洁级雄性SD 大鼠80 只，体重180～220g，购自广州中医药大学实验动物中心，动物许可证编号SCXK(粤)20130020。动物饲料由广州中医药大学实验动物中心提供。辛醇(购自美国SIGMA-ALDRICH 公司)，溶于0.5%的二甲基亚砜(DMSO)(购自美国AMRESCO 公司)溶液。SOD、MDA 及蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 仪器 电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)、低温离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)、紫外分光光度计(Biochrom Ltd)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 SD 只大鼠随机分为假手术组、同一时间点的模型组和辛醇组，每组16 只。根据前期实验结果［4，5］，在缺血后30 min 及2 h 再灌注损伤明显不同，所以选择这2 个缺血时间，即30 min 和2 h 进行辛醇干预。

1.2.2 给药及制备模型 辛醇组于缺血前30 min 按5 mmol/kg 的剂量腹腔给药。脑缺血模型组予以等量的DMSO溶液替代。采用改良的Longa 线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。大鼠腹腔内注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，仰卧固定，颈部正中切口，分离并暴露右侧颈总及颈内、外动脉，并在颈内、外动脉分叉处结扎颈外动脉，右侧颈总动脉剪口，插入头端烧成圆钝形直径为0.26 mm 的尼龙鱼线，进线长度18 mm～19 mm，缺血相应时间(30 min/2 h)拔出线栓。剔除实验期间死亡及模型不成功的大鼠，并及时予以补充。再灌注24 h 后，腹腔麻醉大鼠，迅速断头取脑，用冰冷生理盐水漂洗干净后，除去软脑膜，取缺血大脑半球约300 mg的额、顶叶脑皮质(电子天平称重)，-80 ℃冰箱中冷藏待用。

1.2.3 脑组织匀浆生化指标检测 将脑组织加入9 倍于样品重量的生理盐水，在冰水浴中匀浆制成10%(W/V)的组织匀浆液。置于低温离心机中，以3500 r/min 的转速在4 ℃下离心10 min。取上清液，严格按照说明书要求测定脑组织匀浆中的蛋白浓度、MDA 和SOD 含量。

1.2.4 统计学分析 实验数据采用SPSS19.0 for Windows 软件包统计，各组资料结果均以均数±标准差(±s)表示。样本均数的比较采用单因素方差分析，P＜0.05 表示具有显著性差异，P＜0.01 表示具有非常显著性差异。

2 结果

2.1 各组MDA 含量的比较 同假手术组相比，缺血30 min和2 h 的模型组脑缺血组织中的MDA 含量均明显升高(P＜0.05)，而且2 h 模型组比30 min 模型组含量更高。缺血30 min 的辛醇组，大鼠脑缺血组织中的MDA 含量明显高于30 min 模型组(P＜0.05)。然而，缺血2 h 的辛醇组大鼠脑缺血组织中的MDA 含量明显低于2 h 模型组(P＜0.05)(见表1)。

表1 辛醇对大鼠脑组织匀浆中MDA 和SOD 含量的影响

2.2 各组SOD 含量的比较 同假手术组相比，缺血30 min和2 h 的模型组脑缺血组织中的SOD 含量均明显降低(P＜0.05)，而且2 h 模型组比30 min 模型组含量更低。缺血30 min 的辛醇组，大鼠脑缺血组织中的SOD 含量显著低于30 min 模型组(P＜0.05)。与此相反的是，缺血2 h 的辛醇组大鼠脑缺血组织中的MDA 含量明显高于2 h 模型组(P＜0.05)(见表1)。

3 讨论

目前脑缺血的治疗主要包括两个方面:一方面是改善和恢复缺血区的血液供应，促进微循环;另一方面是使用脑细胞保护剂进行综合治疗，包括钙离子通道阻滞剂、自由基清除剂和兴奋性氨基酸拮抗剂等。然而，目前这些治疗方法的效果不是很理想。近年来大量的实验研究和临床动态观察表明，脑缺血的损伤是进行性的，缺血中心区细胞先发生死亡，继而位于缺血中心区周围、血供相对减少的区域半暗带的细胞逐渐失去活性，梗死范围扩大。但是如果及时给予适当的治疗挽救这些细胞，就会减小梗死体积改善预后。因此拯救位于半暗带的神经元成为治疗脑缺血的关键［6，7］。大量实验表明半暗带神经元的死亡不是局部血流量的减少或缺失直接造成的，它属于继发性损伤:缺血区域的扩散性神经电活动和细胞内钙超载、过量的兴奋性氨基酸和自由基，最终造成细胞膜的破坏和神经元的死亡，使半暗带转变为不可逆性损伤的脑组织。

星形胶质细胞通过提供葡萄糖、重吸收谷氨酸、释放营养因子等对神经元起着重要的支持作用［8］。位于其细胞膜上的缝隙连接是星形胶质细胞中最具有特色的结构，由大量连接小体(主要是connexin 43)有规律排列构成。它允许直径＜1.5 nm 的小分子物质通过，为细胞间物质和信息的传递提供了直接通路［1］。有研究表明缝隙连接抑制剂辛醇可扩大脑缺血30 min 的梗死体积并加重其神经元损伤，却减少脑缺血2 h 的脑梗死体积并减轻其神经元损伤［4，5］。MDA 是氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物。细胞受到氧自由基攻击从而引发链式脂质过氧化反应，产生大量MDA 损伤细胞膜进而使细胞死亡［9］。在本实验中，我们观察到30 min 模型组大鼠的MDA 含量低于30 min辛醇组，而2 h 模型组大鼠的MDA 含量高于2 h 辛醇组。故推测脑缺血30 min 后MDA 浓度较低，通过缝隙连接的引导扩散可降低其对脑组织的损伤;而脑缺血2 h 后MDA的浓度过高，通过缝隙连接的扩散则加大对脑组织的损伤。

SOD 则是细胞的抗氧化酶促防御系统，当体内自由基生成增多时，SOD 可清除超氧阴离子，从而保护细胞免受伤害［10］，故SOD 反映了细胞的自我保护能力。在本实验中，我们观察到30 min 模型组大鼠的SOD 含量高于30 min辛醇组，而2 h 模型组大鼠的SOD 含量低于2 h 辛醇组。推测在脑缺血30 min 后，较多的SOD 通过缝隙连接的扩散可降低脑组织损伤;而脑缺血2 h 后，SOD 的浓度相对不足很难通过扩散对脑组织进行有效地保护，故组织损伤加重。

综上所述，本实验结果表明，缝隙连接抑制剂辛醇对不同缺血时间的双向作用可能与MDA 和SOD 有关，初步论证了国内外学者对缝隙连接在脑缺血中的作用与脑缺血的损伤程度有关的推测［11，12］:如果损伤程度轻，通过缝隙连接引导的有害物质扩散使得损伤性分子的浓度下降，缓冲了它们对神经元的毒性作用占据主要地位，从而起到保护作用;反之如果脑缺血很严重，损伤性分子的浓度升高，通过缝隙连接引导的扩散会损伤到星形胶质细胞自身(bystander death)，清除损伤性分子的能力大大下降，从而增加脑缺血的损伤区域。

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