冰茶栓对骨癌痛大鼠不同脑区亮氨酸脑啡肽和β内腓肽含量的影响

严继贵，王迎新，杨宇清，蔡晶晶

（安徽医学高等专科学校药学系，安徽合肥 230601）

·实验研究·

冰茶栓对骨癌痛大鼠不同脑区亮氨酸脑啡肽和β内腓肽含量的影响

严继贵，王迎新，杨宇清，蔡晶晶

（安徽医学高等专科学校药学系，安徽合肥 230601）

目的 通过观察冰茶栓对骨癌痛大鼠不同脑区亮氨酸脑啡肽（leucine enkephalin，L－EK）和β内啡肽（β－endorphin，β－EP）含量的影响，探讨其抗骨癌痛的中枢作用机制。方法 取雌性SD大鼠30只，采用W256癌细胞骨髓腔注入术复制骨癌痛模型。术后7d选取26只骨癌痛大鼠随机分为冰茶栓组和模型组，每组13只，另取同期饲养的10只大鼠为正常对照组。术后15d开始连续10d给予冰茶栓101mg／kg。分别于手术前后不同时点测量各组大鼠机械痛阈和热痛阈；末次给药后于冰盘取脑，采用放射免疫法检测各组大鼠大脑皮质、丘脑、海马区L－EK和β－EP含量。结果 给药后5d和10d，冰茶栓可显著提高骨癌痛大鼠的机械痛阈和热痛阈（P＜0.05，或P＜0.01）。冰茶栓可明显提高骨癌痛大鼠丘脑区L－EK、β－EP含量及海马区L－EK含量（P＜0.05，或P＜0.01）。结论 冰茶栓对W256癌细胞诱导的骨癌痛大鼠具有明显镇痛作用，其抗骨癌痛作用的中枢机制可能与其提高部分脑区的L－EK和β－EP有关，丘脑和海马可能是冰茶栓镇痛作用的靶部位。

冰茶栓；骨癌痛；亮氨酸脑啡肽；β－内啡肽

冰茶栓是一种临床应用多年的浙江省中医院院内制剂，该制剂是以江浙蝮蛇毒为主药，辅以冰片、茶叶、肉桂等制成的中药复方制剂，主要用途是治疗以疼痛为主的阿片类药物成瘾引起的戒断综合征，对该制剂的开发目前已进入Ⅲ期临床研究阶段（国家食品药品监督管理局临床研究批文：2005L01154）。在临床应用过程中发现，该制剂在辅助治疗晚期癌痛方面收到良好疗效，可大幅度减少重度癌痛患者阿片类止痛药的使用剂量，对部分轻、中度癌痛患者可单用该制剂治疗，且长期使用无依赖性、明显毒性及不良反应。为了寻找该制剂新的适应证，本课题组对其进行的抗癌痛作用相关实验研究结果表明，该制剂可明显提高骨癌痛模型大鼠［1］的机械痛阈和热痛阈，且对骨癌痛大鼠的骨溶解有明显抑制作用［2］；对其作用机制研究结果表明，冰茶栓抗癌痛作用与中枢和外周两种途径均有关［35］。本研究旨在通过观察冰茶栓对骨癌痛大鼠不同脑区亮氨酸脑啡肽（leucine enkephalin，L－EK）和β内啡肽（βendorphin，β－EP）含量的影响，进一步探讨该复方制剂抗癌痛的中枢机制及其可能的作用部位。

1 材料

1.1 实验动物 雌性SD大鼠，清洁级，体质量160～180g。购自浙江中医药大学实验动物中心。实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2012－0011。

1.2 实验药品与试剂 大鼠用冰茶栓（批号20120209），不含药空白栓（批号20120210）：均由浙江中医药大学药学院制剂中心提供；L－EK（批号201203）和β－EP（批号201202）放免试剂盒：北京华英生物研究所；无菌骨蜡：安徽省中医院提供；戊巴比妥钠（批号F20120106）：上海化学试剂公司；注射用庆大霉素（批号12082612）：天津药业焦作有限公司。

1.3 实验用细胞株 W256癌细胞：腹水癌细胞种鼠由浙江医学科学院提供，经本课题组纯化培养所得。

1.4 主要仪器 GC－911型γ放射免疫计数器：中国科技大学实业总公司；TGL－40B离心机：上海安亭科学仪器厂；SL2300二氧化碳培养箱：美国Sheldon公司；FLAT－MYM型高频乳腺摄片机：意大利产；XZC－A型压力测痛仪：山东医学科学院生产；XZC－2B型自控温度热板仪：山东医学科学院生产。

2 方法

2.1 模型复制与筛选 取SD雌性大鼠30只，参照文献［1］方法，将大鼠麻醉后在左侧后肢中上端皮肤切开约1.0cm小口，胫骨暴露后，在胫骨中上1／3

处先用7号针头旋转刺入骨髓腔打孔（适度用力），再用5μl微量注射器抽取3μl约含4×103个W256癌细胞悬液注入骨髓腔，并立即用骨蜡封住针孔，缝合切口，滴撒少许庆大霉素药液预防感染。手术后大鼠常规饲养7d后，3％戊巴比妥钠麻醉，置患肢于高频乳腺摄片机下观察，选取胫骨上端出现明显缺损灶的大鼠用作实验。

2.2 动物分组 选取26只骨癌模型复制成功的大鼠，随机分为冰茶栓组和模型组，每组13只；另取10只同期饲养的大鼠，以生理盐水替代W256癌细胞悬液注入骨髓腔作为正常对照组。

2.3 动物给药 各组大鼠于手术后第15天开始给药，每天2次，共10d。其中正常对照组和模型组直肠给予不含药空白栓；冰茶栓组直肠给予冰茶栓101mg／kg（相当于成人剂量4倍）。

2.4 指标检测

2.4.1 痛阈测量：各组大鼠分别于手术前及手术后第7天、第14天、第19天（给药第5天）、24天（给药第10天），采用足趾压痛法、热板法测量大鼠机械痛阈和热痛阈的变化。①机械痛阈测量：将大鼠患肢足掌置于压力测痛仪压力针正下方，启动电动按钮，使压力摇杆对大鼠足掌压力逐渐增强，以嘶叫或缩足为疼痛反应标志，疼痛反应出现时的压力摇杆质量即为机械痛阈，每只大鼠测量2次，并间隔5 min以上，取2次测量均值作为该大鼠的最终机械痛阈。②热痛阈测量：预先将热板仪温度调至（52± 0.1）℃，将大鼠放置于热板表面，盖上顶盖，以大鼠出现舔后足所需时间作为热痛阈值，每只大鼠测量2次，每次间隔5min以上，取2次测量均值作为该大鼠的最终热痛阈。

2.4.2 放射免疫法测定不同脑区L－EK和β－EP含量：各组大鼠给药第10天，在末次给药后进行痛阈测量，随后脱颈椎处死大鼠，迅速断头取下全脑，立即在冰块上分离出皮质、丘脑、海马，放于Eppendorf管中置沸水浴煮5min，取出称质量后，分别置于玻璃匀浆管内，加入1mol／L HCl 1ml，在冰浴中充分匀浆后转入到塑料试管中，室温放置100min，再加入1mol／L NaOH 1ml用以中和酸，4℃，4 000r／min离心20min，取上清，按照放射免疫试剂盒说明书，采用放射免疫法测定L－EK和β－EP含量。

2.5 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析，连续型变量采用“均数±标准差（±s）”进行统计学描述。多组间均数比较采用单因素方差分析，两组之间均数比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 冰茶栓对骨癌痛大鼠痛阈的影响

3.1.1 冰茶栓对骨癌痛大鼠机械痛阈的影响：与正常对照组比较，模型组大鼠在术后第14天机械痛阈显著下降（P＜0.01），出现机械痛觉过敏；与模型对照组比较，冰茶栓组大鼠给药第5天和第10天机械痛阈显著提高（P＜0.01），提示冰茶栓能明显提高骨癌痛大鼠的机械痛阈。见表1。

表1 冰茶栓对骨癌痛大鼠机械痛阈的影响（±s）

表1 冰茶栓对骨癌痛大鼠机械痛阈的影响（±s）

注：与正常对照组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组 别n机械痛域／kg 10d正常对照10 0.296±0.025 0.288±0.023 0.301±0.031 0.31术前术后7d术后14d给药5d给药2±0.029 0.308±0.027模 型13 0.303±0.026 0.273±0.024 0.254±0.033＊＊0.225±0.028＊＊0.215±0.029＊＊冰茶栓13 0.302±0.033 0.281±0.023 0.262±0.029＊＊0.401±0.042＊＊＃＃0.383±0.051＊＊＃＃

3.1.2 冰茶栓对骨癌痛大鼠热痛阈的影响：与正常对照组比较，模型组大鼠在术后第14天热痛阈显著下降（P＜0.01），出现热痛觉过敏；与模型组比较，冰茶栓组大鼠给药第5天和第10天热痛阈显著提高（P＜0.05，或P＜0.01），提示冰茶栓能明显提高骨癌痛大鼠的热痛阈。见表2。

表2 冰茶栓对大鼠热痛阈的影响（±s）

表2 冰茶栓对大鼠热痛阈的影响（±s）

注：与正常对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组 别n热痛域／s 10d正常对照10 18.9±4.3 18.2±5.2 18.3±3.9 19.1±3.7 19.6±术前术后7d术后14d给药5d给药3.1模 型13 19.2±4.1 17.1±3.2 12.5±3.7＊＊11.5±3.1＊＊10.8±2.6＊＊冰茶栓13 20.1±4.5 17.8±2.3 12.7±4.2＊＊26.5±6.1＊＃＃25.9±5.8＊＃＃

3.2 冰茶栓对骨癌痛大鼠不同脑区L－EK、β－EP含量的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠丘脑区L－EK、β－EP含量及海马区L－EK含量均显著降低（P＜0.05，或P＜0.01）；与模型组比较，冰茶栓组

大鼠丘脑区L－EK、β－EP含量及海马区L－EK含量均显著升高（P＜0.01）。3组皮质区L－EK和β－EP水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明，冰茶栓可明显提高骨癌痛大鼠丘脑区L－EK、β－EP含量及海马区L－EK含量。见表3。

表3 冰茶栓对骨癌痛大鼠不同脑区L－EK、β－EP含量的影响（±s）

表3 冰茶栓对骨癌痛大鼠不同脑区L－EK、β－EP含量的影响（±s）

注：与正常对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组 别nL－EK／（pg／mg）β－EP／（pg／mg）皮质丘脑海马正常对照10 3.65±1.21 15.13±3.89 11.23±1.32 0.47±0.1皮质丘脑海马2 2.37±1.45 4.38±2.25模 型13 3.58±1.68 11.83±3.41＊7.49±2.53＊＊0.45±0.28 1.23±0.88＊4.13±2.58冰茶栓13 4.26±1.87 19.15±5.10＊＃＃10.89±3.62＃0.61±0.29 6.15±2.82＊5.43±2.37＃＃

4 讨论

内源性阿片肽是机体内主要的镇痛物质。在阿片肽家族中，不同阿片肽类物质在镇痛部位及性质上又有所不同。其中，L－EK是δ受体的内源性配体，主要分布于下丘脑、海马、大脑皮质、纹状体及杏仁核等区域，是脑内含量最高的内源性神经肽，具有广泛的镇痛作用［6］。β－EP是μ受体和δ受体的内源性配体，是一种由31个氨基酸组成的多肽，它的脑内含量远大于脊髓，广泛分布于脑内各区，如丘脑、垂体、海马、大脑皮质，具有较强的吗啡样活性和镇痛作用。β－EP的神经细胞胞体主要集中于下丘脑－垂体轴中，其纤维通路主要包括弓状核－边缘系统、弓状核－下丘脑、弓状核－脑干［7－8］。

痛觉的传递系统包括3个主要部分，即外周感觉神经、脊髓到脑干和丘脑的神经细胞网络以及丘脑和大脑皮质的相互联系，包括丘脑、脑桥、中脑在内的皮质下中枢和大脑皮质构成了痛觉中枢。其中，丘脑的许多核团对疼痛有着显著的调控作用，传递痛觉的脊髓丘脑束纤维就终止在丘脑的不同核团上。在这些核团中，含有对伤害性刺激的痛敏神经细胞，参与疼痛的兴奋或抑制作用。同时，刺激下丘脑的前部、中部、后部和视上核可提高痛阈，产生明显的镇痛作用。因此，丘脑是疼痛传递和调制中非常重要的整合中枢［9－10］。

本研究旨在前期药效研究的基础上，初步探讨冰茶栓抗癌痛可能的中枢机制及其作用部位，故而在实验设计中仅选择了药效研究中镇痛作用最显著的101mg／kg单剂量给药，以避免重复研究。本次研究结果表明，自手术后第14天开始，模型大鼠机械痛阈和热痛阈均显著下降（P＜0.01），出现明显的机械痛觉和热痛觉过敏，该结果与以往研究结果［11］相符。而冰茶栓能够显著升高W256癌细胞诱导的骨癌痛大鼠机械痛阈和热痛阈值，显示出较好的抗癌痛作用。对冰茶栓中枢作用机制研究结果显示，冰茶栓可明显升高骨癌痛大鼠丘脑区内源性L－EK、β－EP含量，对海马组织的L－EK含量也有升高作用，该结果表明冰茶栓镇痛效应的发挥可能与其对中枢内源性阿片肽的调控有关。这一点与笔者以往对冰茶栓进行的拆方研究结果［3］是一致的。调节中枢相关脑区L－EK、β－EP等内源性阿片肽含量，可能是冰茶栓发挥抗癌痛效应的中枢作用机制之一，其中丘脑与海马（尤其是丘脑）可能是其发挥镇痛作用的靶部位。

由于蛋白质和肽类药物在消化道易被酶所水解，且存在肝脏的首过效应，采用直肠给药能较好地避免。一般来说，分子量小于5 000Da的小分子不需使用吸收促进剂即可吸收进入体循环，分子量较大的则较难吸收。冰茶栓是以江浙蝮蛇毒（内含大分子多肽）为主药的复方制剂，该制剂中含有冰片等吸收促进剂，能有效地促进大分子多肽的吸收［12］。相关研究［13］表明，冰片还有改善血脑屏障通透性的功能，提示冰茶栓中大分子肽类能够进入中枢起作用与冰片等吸收促进剂有关。

［1］俞丽霞，王泽时，严继贵.Walker－256细胞株在创建骨肿瘤痛模型中的应用：中国，CN101191123［P］.2008－06－04.

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Effects of Bingcha Suppository on Content of Leucine Enkephalin andβ－Endorphin in Different Brain Areas of Rats with Bone Cancer Pain

YAN Ji－gui，WANG Ying－xin，YANG Yu－qing，CAI Jing－jing
（Department of Pharmacy，Anhui Medical College，Anhui Hefei 230601，China）

Objective To study the effects of Bingcha Suppository on the content of leucine enkephalin（LEK）andβ－endorphin（β－EP）in different brain areas of rats with bone cancer pain and to investigate its centrally acting mechanism in the treatment of bone cancer pain.Methods Thirty female Sprague－Dawley rats were selected in the study.W256tumor cells were injected into the rat marrow cavity to induce a model of bone cancer pain.At 7days after the operation，26rats with bone cancer pain were randomly divided into Bingcha Suppository group（n＝13）and model group（n＝13）；another 10rats raised during the same period were selected as normal control group.From the 15th day after the operation，the rats in Bingcha Suppository group were given Bingcha Suppository（101mg／kg）for 10days.The mechanical and thermal pain thresholds were measured before and at different time points after the operation.After the last administration，all rats were beheaded and the cerebral cortex，thalamus，and hippocampus were separated from the brain.The content of L－EK andβ－EP in the cerebral cortex，thalamus，and hippocampus were measured by radioimmunoassay.Results On days 5and 10of treatment，the Bingcha Suppository group had significantly increased mechanical and thermal pain thresholds（P＜0.05or P＜0.01）and significantly increased content of L－EK andβ－EP in the thalamus and content of L－EK in the hippocampus（P＜0.05or P＜0.01），as compared with the model group.Conclusion Bingcha Suppository has good analgesic effect in rats with bone cancer pain induced by W256tumor cells.The analgesic mechanism of Bingcha Suppository is probably related to its increasing the content of L－EK andβ－EP in some brain areas，and the thalamus and hippocampus may be the target areas of Bingcha Suppository.

Bingcha Suppository；bone cancer pain；leucine enkephalin；β－Endorphin

R73－36

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.02.022

2013－12－05）

安徽省高等学校省级优秀青年人才

（2010SQRL209）

严继贵（1975－），男，博士，副教授