似鲇高原鳅败血症病原菌的分离鉴定与病理学观察

周 燕，耿 毅，汪开毓，阳 磊，刘 丹，徐敬钧，陈德芳，黄小丽

(四川农业大学 动物医学学院，四川 雅安 625014)

似鲇高原鳅(Triplophysa siluroides)属鲤形目，鳅科，条鳅亚科，高原鳅属，冷水性鱼类，体表花纹呈虎斑状，俗称“老虎鱼”，主要分布于青海、四川、甘肃和宁夏的黄河干流及主要支流[1]。由于在自然分布区域被大量捕捞，从而导致资源量大幅度下降，目前仅在人烟稀少的高原地区有一定数量[2]。为更好保护与利用似鲇高原鳅，近年来在四川与青海等地逐渐开始了似鲇高原鳅的人工养殖与繁殖，但人为控温、配合饲料使用与高密度养殖等改变及破坏了似鲇高原鳅的自然生活习性，致似鲇高原鳅抗病能力下降，不时有疾病的发生。

2012 年9 月，四川省雅安市某养殖场似鲇高原鳅暴发了以体表出血、明显神经症状和内脏器官变性、坏死为特征的败血性疾病，其累计死亡率达30 %以上。为明确其病原，本研究从患病似鲇高原鳅体内分离鉴定到一株致病菌，并对其致病性进行了研究，为有效防控和诊断该病提供了依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 患病似鲇高原鳅采自四川省雅安一水产养殖场，体长10 cm，体质量约20 g，具有明显出血性败血症的个体13 尾，用于剖检观察、病料采集和病原菌分离。健康似鲇高原鳅100 尾，体质量约20±2.5 g 购自未发病的养殖场。

1.2 病原菌的分离与纯化 选取具有典型症状的似鲇高原鳅，无菌操作从肝脏和肾脏取样，BHIA 平板上划线，28 ℃培养24 h～36 h 后，挑取形态特征一致的优势菌落进行纯化。纯化后获得一株分离菌。

1.3 人工感染试验 参考文献[3]采用两种感染方式进行。一种为腹腔注射1.0×106cfu/mL 菌液，每尾0.1 mL，同时以等量无菌生理盐水对照，试验观察期14 d。另一种为浸泡感染，试验鱼浸泡于浓度为1.0×107cfu/mL 菌液1 h 后，转入清水中，试验观察期21 d。

1.4 分离菌的鉴定

1.4.1 表型特征检测 分离菌接种兔血BHIA 琼脂平板、TSA 和普通琼脂平板等，28 ℃培养24 h～48 h，观察菌落生长与形态特性，同时革兰染色观察菌体形态与染色特征。按照《常用细菌系统鉴定手册》[4]的方法进行主要生理生化特性检测。

1.4.2 16S rDNA、gyrB 基因序列分析 以分离菌总DNA 为模板，PCR 扩增16S rDNA 的引物为：5'-A GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/5'-TACGGCTACCTT GTTACGAC-3'[5]；PCR 扩增gyrB 基因引物为5'-GA AGTCATCATGACCGTTCTGCA-3'/5'-AGCAGGGTAC GGATGTGCGAGCC-3')[6]。PCR 反应条件：94 ℃5 min；94 ℃1 min、54 ℃1 min、72 ℃1 min，共30 个循环；72 ℃10 min。PCR 产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，通过NCBI 中的Blast 进行序列分析，N-J 法构建系统进化树。

1.5 药敏试验 参照NCCLS 抗微生物药物敏感性试验[7]执行标准采用纸片法进行。

1.6 病理学观察 对收集的发病鱼进行剖解，观察各组织、器官的病理变化。取患病鱼的组织样品按常规方法制做病理组织切片，HE 染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察记录。

2 结果

2.1 临床病症与剖解观察 患病似鲇高原鳅主要表现为食欲减退，体表褪色，在养殖池中阵发性螺旋状游动，体侧壁、腹部、鳍条基部与下颌充出血，颅顶出血发红，眼球外凸并伴有出血，腹部膨大，肛门红肿。解剖可见病鱼腹腔中有少量血色腹水，肝肿大，质地较脆；脾颜色发黑；肾肿大，呈暗红色；肠道充血、出血，肠腔内有淡黄色水样液体；脑肿胀，脑膜充血；鳃丝肿胀发黑伴有坏死。

2.2 病原菌分离 从患病似鲇高原鳅脑、肝与肾取样BHIA 平板划线，经28 ℃培养36 h 获得1 株G-短杆的优势菌，菌落直径0.2 mm～0.3 mm，表面光滑，边缘整齐，无色透明的圆形菌落。

2.3 人工感染试验 分离菌经腹腔注射和浸泡感染的方法均能使健康的似鲇高原鳅发病，并表现出自然感染相似的症状与病变。腹腔注射健康似鲇高原鳅在3 d～6 d 内发病死亡，死亡率为80 %(12/15)；而浸泡感染发病则较为缓慢，在3 d 后开始出现食欲减退，5 d 后开始死亡，死亡主要集中在7 d～12 d，死亡率为66.7 %(10/15)，对照组均未见任何异常。同时，从人工感染发病鱼体内重新分离到菌株，其形态特征和主要生理生化特性与原分离菌株相同(图1)。

图1 细菌分离株不同人工感染途径对似鲇高原鳅致死情况Fig.1 The mortality of the bacteria isolate to the fish via different inoculated routs

2.4 分离菌的鉴定

2.4.1 培养特性 分离菌在普通琼脂上不生长；在TSA 培养基上生长不良，经48 h 培养仅形成直径约0.1 mm，表面光滑，无色透明的圆形菌落。在兔血BHIA 琼脂培养基上出现β 溶血特性。

2.4.2 生理生化特性 分离菌对过氧化氢酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶显示阳性，对氧化酶阴性；发酵葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖，不利用棉籽糖、阿拉伯糖、纤维二糖、木糖、蔗糖、甘露醇、肌醇、水杨苷；还原硝酸盐；H2S 产气。综上可初步判定分离菌为鮰爱德华氏菌(Edwardsiell ictaluri)。

2.4.3 16S rDNA 与gyrB 基因序列比对和系统发育树分析 分离菌的16S rDNA 和gyrB 基因经PCR 扩增后，分别得到约1 500 bp 和1 200 bp 片段，Gen-Bank 登录号分别为KF952599、KJ001821。将获得片段经测序后比对分析，结果表明，分离菌的16S rDNA 与gyrB 基因序列与E.ictaluri 的同源性均高达99 %以上。系统发育树分析(图2、3)显示，分离菌与E.ictaluri 聚为一族，与来源于其他水生动物的E.ictaluri 同源性分别达96.4 %～99.4 %和97.8 %～99.0 %，结合形态、生理生化特性，分离菌株鉴定为E.ictaluri，并将其命名为GYQ 株。

图2 16S rDNA 序列的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of homology

图3 gyrB 基因序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on gyrB gene sequence of homology

2.5 药敏试验 分离菌对抗生素的敏感性试验结果见表1。

表1 分离菌的药物敏感试验结果Table 1 The sensitivity of the pathogen to antibiotics

2.6 病理组织学观察 肝：肝细胞出现严重的空泡变性(图4A)；病变严重区域肝小叶内见灶性坏死，肝细胞结构破坏，嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞与淋巴细胞浸润(图4B)；中央静脉及小叶间血管壁增厚，淋巴细胞、巨噬细胞浸润，表现为血管炎。胰腺腺细胞坏死，大量嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞浸润(图4C)。

肾：肾间质严重出血，大量巨噬细胞、中性白细胞和淋巴细胞浸润(图4D)；肾小管上皮细胞变性、脱落，一些肾小管腔内出现淡红染的蛋白管型或含有脱落上皮细胞的混合管型，病变严重区域的肾小管管腔结构已完全破坏，肾小球肿大，毛细血管扩张充血，血管内皮细胞与网状细胞增生(图4E)。

脾：脾明显充血、出血，脾组织内淋巴细胞坏死，数量显著减少，巨噬细胞、中性白细胞及血细胞的数量明显增多(图4F)，同时可见多量含铁血黄素沉积。

脑：脑膜疏松，增厚，大量巨噬细胞、淋巴细胞和是酸性粒细胞侵润增；脑基质水肿，神经元肿胀，毛细血管周间隙增宽，表现为明显的脑膜脑炎(图4G)。

鳃：鳃上皮细胞坏死、脱落、溶解，鳃小片毛细血管裸露，甚至毛细血管断裂、坏死，鳃小片间大量中性白细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞浸润，表现为坏死性鳃炎(图4H)。

肠道：肠绒毛粘膜上皮细胞严重坏死脱落，肠腔内充滞大量坏死脱落的上皮细胞和炎性渗出物，固有膜增厚，大量炎性细胞浸润(图4I)，严重区域见肠绒毛断裂、溶解，表现为坏死性-卡他性肠炎。

图4 患病似鲇高原鳅组织病理变化Fig.4 Pathological changes of diseased catfish-like loach

3 讨论

E.ictaluri 属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)爱德华氏菌属(Edwardsiella)，革兰阴性短杆菌，最早于1979 年由Hawke 从发病的斑点叉尾鮰体内分离发现[8]，被认为是严重危害斑点叉尾鮰的重要细菌性传染病“肠型败血症”的病原菌[8-9]，而后在其他鱼类也有感染致病的报道[10]。在本研究中，从表现为败血症的自然发病似鲇高原鳅体内分离鉴定了E.ictaluri，并通过人工感染试验证实为似鲇高原鳅败血症的病原菌。似鲇高原鳅属鲤形目，鳅科，高原鳅属的冷水性鱼类，到目前为止，还未见鳅科鱼类感染E.ictaluri 的报道。本研究首次报道了E.ictaluri 可自然感染似鲇高原鳅并致病。研究表明，E.ictaluri 至少存在两个血清学特性与质粒构型不同的型[10]，而这些生物学特性的差异是否与感染特性，尤其是否与宿主范围差异有关，还需要进行进一步的研究。

E.ictaluri 感染鱼类的途径主要是消化道、鳃和鼻腔，当其经消化道或鳃感染时，细菌进入血液并迅速分布于机体各组织器官，引起各组织器官的充血、出血、炎症、变性、坏死和溃疡等典型的败血症症状，即急性型；但当其经鼻腔侵入嗅球，再经嗅球移行到脑，引起颅顶发红、出血、溃烂的典型病变，则为慢性型[11]。在本研究中，在自然感染发病的似鲇高原鳅中也表现出了以上两种临床类型，与E.ictaluri 感染斑点叉尾鮰和黄颡鱼等鲇形目鱼类相似[11-12]。病理组织变化显示，E.ictaluri 感染似鲇高原鳅致多组织、器官损伤，表现为明显的变性、坏死与炎症反应，尤其是肝、肾、脾、鳃、肠和脑的病变较为严重，从而导致多器官功能障碍综合征，最终引发感染鱼死亡。似鲇高原鳅感染E.ictaluri 的病理组织学损伤特点与斑点叉尾鮰和黄颡鱼等感染E.ictaluri 相似，但对于这些损伤引发的原因是病原菌直接侵袭的结果，还是病原菌毒力因子作用的结果，还需要采用电镜技术与免疫组化技术等对病原菌在体内的分布与病理损伤的相关性进行研究，以进一步阐明鮰感染的致病机制。

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