CPP-ACP及氟促进脱矿牙骨质再矿化的体外实验

马忠雄，卢友光，卢国英

CPP-ACP及氟促进脱矿牙骨质再矿化的体外实验

马忠雄，卢友光，卢国英

目的比较普通含氟牙膏、酪蛋白磷酸肽钙磷复合体（CPP-ACP）及含氟CPP-ACP（CPP-ACPF）促进脱矿牙骨质再矿化的效果。方法制备健康牙骨质块，开窗后脱矿液脱矿96h，分为空白对照组、普通含氟牙膏组、CPP-ACP组和CPP-ACPF组，每组10个样本，将实验药品按要求在牙骨质表面反复涂擦3min，流水冲洗5min，每天1次。28d后扫描电镜观察各组牙骨质表面形貌，通过能谱分析测定牙骨质表面的微区成分（Ca、P含量及Ca／P），采用SPSS 17.0统计软件对各组间Ca、P、Ca／P进行单因素方差分析。结果扫描电镜结果显示各组牙骨质表面形貌不同：与对照组相比，各实验组再矿化后均可见不同程度矿物质沉积，以CPP-ACPF组沉积物最厚。能谱分析结果显示各实验组钙磷含量均较对照组明显升高，各实验组之间的差别无统计学意义。结论CPP-ACP及CPP-ACPF均能促进脱矿牙骨质再矿化，CPP-ACP与氟可能具有协同抗龋作用。

酪蛋白类；复合体；氟；牙；牙失矿质；牙釉质；牙再矿化；牙骨质；显微镜检查，电子，扫描

根面龋是老年人及牙周病患者最常见的牙体硬组织疾病，其广泛流行性及临床损害的特殊性使治疗难度加大且疗效不佳，因此根面龋的有效预防尤为重要。氟化物防龋已有近百年的历史，作为目前广泛使用的防龋药物，其防龋效果已得到各方面认可。酪蛋白磷酸肽钙磷复合体（casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate，CPP-ACP）取自牛奶酪蛋白，作为一种新型纳米级生物防龋制剂，具有促进脱矿牙体硬组织再矿化、间接抑制致龋菌并干扰致龋菌斑形成等作用［1－3］。已有的研究显示，CPP-ACP与氟联合使用时具有协同的抗龋效果。但目前关于CPP-ACP及氟的抗龋研究多集中于牙釉质，二者能否对根面牙骨质发挥防龋作用尚不明确。本实验以扫描电镜观察脱矿牙骨质表面应用CPP-ACP及氟后的形貌变化，并通过能谱分析测定牙骨质表面的微区成分，以明确CPP-ACP及氟促进脱矿牙骨质再矿化的效果。

1 材料与方法

1.1 对象 从口腔颌面外科门诊要求拔除第三磨牙的患者中选取10名成年人，男性5例，女性5例，年龄（28±6.11）岁（18～40岁），收集10颗完整拔除的新鲜第三恒磨牙（上颌4颗，下颌6颗）。实验对象无系统性疾病，未经过牙周治疗，釉牙骨质界以下的根面完全被牙龈覆盖，探诊深度≤3mm，无龋坏及充填物。

1.2 主要材料与仪器GC Tooth Mousse［含10%（w／v）CPP-ACP，日 本 GC 公 司］、GC Tooth Mousse Plus［含10%（w／v）CPP-ACP和0.9g／L氟），日本 GC公司］；高露洁360°牙膏（含氟量1.45g／L）；场发射扫描电镜（Nova NanoSEM230，美国FEI公司）；能谱分析仪（INCA x-MAX，英国OXFORD公司）。

1.3 方法

1.3.1 测试样本制备 牙齿拔下后，生理盐水冲洗，去除表面黏附的血及唾液，2.5%次氯酸钠浸泡24h除去牙骨质表面有机物。低速涡轮机流水下去除牙冠、牙根冠1／3、根尖1／3，保留根中1／3，并沿根管纵剖，每牙分为4部分，随机纳入4个实验组，去离子水中保存备用。

1.3.2 脱矿 10颗牙共40个样本保留牙骨质表面3mm×3mm开窗区，其余部分用抗酸指甲油封闭，浸没于脱矿液（0.05mol／L 醋酸，2.2mmol／L氯化钙，2.2mmol／L 磷酸二氢钾，pH 4.6）中，37℃持续脱矿96h［4］，脱矿后流水冲洗。

1.3.3 再矿化实验 实验共分为4组，空白对照组、普通含氟牙膏组、CPP-ACP组和 CPP-ACPF组。用小毛刷取用实验药品绿豆大小，于牙骨质表面反复涂擦3min，流水冲洗5min，1次／d，共28d。空白对照组使用去离子水涂擦，普通含氟牙膏组使用含氟量为1.45g／L的高露洁360°牙膏涂擦，CPP-ACP组使用含10%CPP-ACP的 GC Tooth Mousse涂擦，CPP-ACPF组使用含10%CPP-ACP和0.9g／L氟的GC Tooth Mousse Plus涂擦。上述每次操作后将牙骨质块贮存于去人工唾液（按ISO／TR10271标准配制）中，人工唾液每日更换。1.3.4 扫描电镜观察及能谱分析 实验结束后各组均浸没于2.5%次氯酸钠溶液中，超声荡洗10min，流水冲洗5min，10颗牙40个样本自然干燥，脱水，喷金，扫描电镜观察牙骨质块表面，比较同牙各组牙骨质表面的异同；在牙骨质表面随机选取5个点状区域进行微区成分（Ca、P）能谱分析，取其平均值。

2 结 果

2.1 牙骨质表面形貌 扫描电镜放大5 000倍下观察，各组牙骨质表面形貌有较大差异：空白对照组牙骨质表面可见大小不等的圆形或椭圆形孔隙，基质纤维暴露，轮廓清晰，纤维束交织成网，未见断裂；普通含氟牙膏组牙骨质表面可见矿物质沉积，部分脱矿形成的孔隙被遮盖变小，部分尚未被遮盖，基质纤维轮廓不清；CPP-ACP组牙骨质表面矿物沉积质将牙骨质表面覆盖，未见脱矿孔隙，基质纤维轮廓不清；CPP-ACPF组牙骨质表面矿物沉积物最厚，牙骨质表面被完全覆盖，脱矿孔隙和基质纤维完全不可见（图1）。

图1 扫描电镜下各组牙骨质表面形貌Fig 1 FE-SEMobservation of cementum surfaces of each group

2.2 微区成分分析 各实验组牙骨质表面Ca、P含量均较对照组明显升高，差别有统计学意义，各实验组之间差别无统计学意义。各实验组及对照组之间Ca／P差别无统计学意义。结果见表1。

表1 实验组和对照组牙骨质表面微区成分比较Tab 1 The percent of mineral contents of each group

3 讨 论

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）是以牛奶酪蛋白为原料，经单一酶或复合酶系水解、分离纯化而得到的富含磷酸丝氨酸且具有高度热稳定性和溶解性的生物活性肽［5－6］。CPPs能与钙磷结合成复合体，即酪蛋白磷酸肽钙磷复合体（CPPACP），它是可溶性复合物，为钙磷两种矿物元素的生物可利用形式。若附着在龋损处，则可维持高水平的钙离子浓度，促使钙离子进入龋损区，促进早期龋损再矿化［7］；并可限制矿物质的流失并为后来的再矿化提供了一个电势源，从而达到抑制脱矿、促进再矿化的作用［8］。其抗龋活性已在实验室、动物实验和临床试验中得以证实。本实验的研究结果显示，使用含10%CPP-ACP的 GC Tooth Mousse，可在脱矿牙骨质表面形成矿物质沉积物，具有促进脱矿牙骨质再矿化的作用，说明其对早期根面龋可能具有治疗作用。

氟通过降低釉质溶解度和促进釉质再矿化、对微生物产生作用以及影响牙的形态而预防龋病。氟的抗龋效果依赖于牙齿表面氟离子的局部应用，它可通过羟基置换或溶解羟基磷灰石的再沉淀结合至羟基磷灰石结构中，形成溶解度更低的氟化物，这是氟防龋的主要因素［9－10］。此外，当唾液或菌斑中的钙磷离子达到足够量时，氟离子可促进先前脱矿的组织发生再矿化。因此局部用氟时，钙磷离子的可用性对于防龋效果至关重要［11］。由于牙骨质结构与釉质差别较大，其中无机物含量比釉质低，而所含有机基质可占组织干重的40%～50%，大大高于牙釉质中的1%［12］，因此其再矿化机制更为复杂，普通含氟牙膏效果不佳。本实验也证实，使用含氟量为1.45g／L普通含氟牙膏，虽可见部分矿物质沉积，但再矿化明显不足。因此有学者认为抑制根面龋需要更高浓度的氟［13－14］，因而需要更高浓度的含氟牙膏才能再矿化根龋。目前，国外用于再矿化根龋的牙膏为含氟量为5g／L的牙膏，但氟所引起的一系列局部和全身的毒副作用使得高浓度氟化物的应用受到一定限制。

为避免高浓度氟化物的副作用，发挥CPP-ACP的生物活性钙磷储库的优势，有学者对二者的联合使用的效果进行了研究。Reynolds等在1995年一项鼠龋病模型中证实CPP-ACP纳米复合物与氟具有协同效应［15］；在2008年的体外实验中，Reynolds等比较了2%CPP-ACP与不同浓度氟分别使用与联合使用的抗龋效果，结果显示二者联合使用效果更好，进一步证实CPP-ACP与氟具有协同抗龋效应［11］。Cross认为CPP在稳定钙磷离子的同时，还可稳定氟离子，CPP-ACP加氟形成酪蛋白磷酸肽钙氟磷复合体（CPP-ACFP），其超微结构为半径（2.12±0.26）nm的无定形的毫微簇。其中每一个缩氨酸结合15个钙离子、9个磷酸根离子和3个氟离子。此外氟化物局部应用后形成的氟磷灰石会将表面迅速覆盖，而CPP的存在可阻止磷酸钙相的迅速形成，离子得以稳定并保持活性，从而渗透入表层下病变，促进病损整体的再矿化，而不仅局限于表层［16］。王伟萍等在抑制牛牙早期釉质龋的体外研究中证实CPP-ACP能够减少牙釉质脱矿并促进再矿化，并与氟化钠在防龋方面具有协同作用［17］。本实验也证实，使用含10%CPP-ACP及0.9g／L氟的GC Tooth Mousse Plus，在脱矿牙骨质表面形成矿物质沉积物最厚，说明对于牙骨质，CPP-ACP与氟也具有协同抗龋作用。

牙骨质结构的复杂性及其所处的微生态环境决定了其再矿化并非单纯的理化进程，牙菌斑及其中微生物发挥着至关重要的作用。大量研究显示CPP-ACP的局部应与牙菌斑生物膜密切相关。研究发现，CPPs可被免疫定位在细菌细胞膜和细胞间基质中，可诱导口内生物膜的延迟形成，并通过选择性抑制产生非致龋性牙菌斑，此外，还有可能通过提高游离钙的浓度，产生额外的抗菌斑效果［8，18－20］。CPP-ACP的每种潜在的作用模式（抑制脱矿，促进再矿化，减少黏附，抑菌／杀菌作用）均与氟的作用一一对应，两者联合应用的效果有待深入研究。

综上所述，本实验条件下单独使用10%CPPACP或单独用1.45g／L氟，均可促进脱矿牙骨质表面矿物质沉积，两者合用效果最优，CPP-ACP与氟可能具有协同抗龋作用。但本实验尚未将微生物因素纳入研究范围，今后将进一步研究牙菌斑生物膜对CPP-ACP及氟对牙骨质发挥再矿化作用的影响，为其临床应用提供依据。

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（编辑：何佳凤）

Remineralization of Artificial Demineralized Cementum by CPP-ACP and Fluoride Dentifriceinvitro

MA Zhongxiong，LU Youguang，LU Guoying
School and Hospital of Stomatology，Fujian Medical University，Fuzhou 350002，China

ObjectiveTo assess and compare the effect of fluoride dentifrices，CPP-ACP and CPP-ACPF in remineralization of artificial demineralized cementum.MethodsSound human cementum fragments obtained from the third molar were stored in a demineralization solution for 96hat 37℃to induce artificial demineralization lesions. The fragments were then randomly divided into four treatment groups including control group，fluoride dentifrices group，CPP-ACP group and CPP-ACPF group. The demineralized samples were treated with different material for 3min per day. After 28days the samples were evaluated using field emission-scanning electron microscopy（FE-SEM）. The SEMobservations revealed different morphological features brought about by CPP-ACP，and the energy spectrometry analysis was used to measure the mineral contents in cenentum （Ca，P，Ca／P）. The data was analyzed using ANOVA with SPSS17.0software package.. ResultsDifferent thickness deposits of mineral were observed in each group except the control one，and the thickest were observed in CPP-ACPF group. The mineral contents were significantly higher than those in the control group（P＜0.05）.Conclusions CPPACP and fluoride are all effective in remineralizing artificial demineralized cementum. CPP-ACP and fluoride have synergistic effect in caries prevention.

compomers；caseins；fluorine；tooth；tooth demineralization；dental enamel；tooth remineralization；dental cementum microscopy，electron，scanning

R319.3；R446.8；R780.1；R781.1

A

1672-4194（2014）01-0038-04

2013-12-30

福建省自然科学基金（2010J01161）；福建省教育厅课题（JB12126）

福建医科大学 附属口腔医院黏膜科，福州 350002

马忠雄（1972－），男，副主任医师，副教授，医学硕士

卢友光.Email：fjlyg63＠163.com

读者－作者－编者