新生霉素衍生物FM-Nov17抑制慢粒白血病细胞增殖与其诱导DNA损伤的关系

吴丽贤， 黄立森， 陈显凌， 柯 方， 郑 鸣， 许建华

新生霉素(Nov)是香豆素类抗生素的代表药物，对DNA拓扑异构酶Ⅱ有很好的抑制作用[1]，在体内外能够抑制多种癌细胞的增殖，但由于其活性较低，一般用于抗癌药联合应用及逆转抗癌药的耐药性[2]。前期对Nov的抗肿瘤机制的研究还表明，Nov是热休克蛋白90(HSP90)的C端抑制剂，能够抑制HSP90的分子伴侣功能，影响客户蛋白的正确结构和功能，间接发挥抗肿瘤作用，但其抗癌活性很低，对白血病K562细胞的IC50高达500 μmol/L[3-4]。

损伤DNA是当前临床治疗肿瘤常用的放射治疗及绝大多数细胞毒类抗癌药物共同的分子机制。在DNA损伤中，双链断裂对肿瘤细胞是最致命的打击，主要检测性标志是γ-H2AX；它的修复主要通过两种机制实现：一种是同源重组(HR)，另一种是非同源末端连接(NHEJ)，断裂的DNA末端重新连接，可以在没有模板的情况下进行DNA修复，但也更容易发生错误。DNA修复能力异常激活和增强是导致肿瘤对DNA损伤剂耐药的重要分子基础；相反，修复缺陷则使肿瘤对其高敏感。目前已有十余种靶向不同DNA修复分子的化合物正在进行不同阶段的临床试验。

本课题组以Nov为母体化合物进行改造，获得一系列衍生物，通过体外抗肿瘤活性的筛选，获取了抗肿瘤活性较强的化合物FM-Nov17。本研究试图探讨FM-Nov17在体外抗K562及K562/G01细胞增殖的作用与其诱导DNA损伤的关系。

1 材料与方法

1.1材料 K562和K562/G01细胞(由福建医科大学生物医药工程中心库存保种)；化合物FM-Nov17由本课题组合成，纯度96%以上；羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)、RNA酶和碘化丙啶(PI)；四甲基偶氮唑盐(MTT，美国Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)；RPMI 1640培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；γ-H2AX，p-ATM，p-Chk1，p-Chk2，Parp，p-P53，CDC25A，CDC25C，cleaved Caspase3单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；β-actin单克隆抗体和羊抗鼠、羊抗兔IgG-HRP二抗(南京凯基生物科技发展有限公司)；ECL超强发光底物(美国Signalway antibody公司)；BCA蛋白定量试剂盒与流式凋亡检测试剂盒(瑞士Roch公司)；JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(南京凯基公司)；成像系统(Image station 4000MM，日本柯达公司)；流式细胞仪(FACSCanto Ⅱ，美国BD公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 K562细胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640、青霉素(100 IU/mL)和链霉素(50 μg/mL)，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵育箱中培养；K562/G01细胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640、青霉素(100 IU/mL)和链霉素(50 μg/mL)，于4 μmol/L IM维持培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2MTT试验 96孔培养板上每孔种植10 000个细胞，体积为200 μL，实验组分别加入不同浓度的FM-Nov17和Nov，对照组不加药。另设空白组(只加培养基，无细胞)，每组设3个副孔，37 ℃培养48 h，每孔加入5 μg/mL的MTT溶液20 μL[4]，继续培养4 h，1 000 r/min离心5 min弃上清，加入150 μL DMSO，振荡10 min，用全自动酶标仪检测570 nm处的吸光度(OD)值，结果采用GraphPad Prism 5 软件分析，并绘制相应的存活率-对数浓度曲线，计算药物的半数抑制率(IC50)。

1.2.3细胞增殖代数检测 取对数生长期的K562及K562/G01细胞，用5 μmol/L CFSE 37 ℃预先处理10 min[5]，用4 ℃的含有10% FBS的RPMI 1640培养液终止反应并洗涤细胞2次，按实验设计分组并加入不同浓度的FM-Nov17处理72 h。收集细胞，PBS洗涤2次，流式细胞仪检测，结果采用Modfit软件分析。

1.2.4DNA损伤检测 取对数生长期K562及K562/G01细胞，10 μmol/L的Brdu预处理30 min，不同浓度的FM-Nov17处理细胞24 h，收集细胞，以800 r/min离心5 min，弃上清，破膜，DNase处理1 h，anti-BrdU，anti-γ-H2AX，anti-cleaved Parp荧光探针室温孵育20 min，按试剂盒说明操作，流式细胞仪检测。

1.2.5细胞线粒体膜电位检测 取对数生长期的K562和K562/G01细胞，分组并加入不同浓度的FM-Nov17处理4 h；收集细胞，1 000 r/min离心5 min；用冷PBS重悬洗涤细胞2次；按JC-1试剂盒的说明配置JC-1染料，37 ℃避光孵育20 min染色；1 000 r/min离心收集细胞，PBS重新悬浮细胞，流式细胞仪检测线粒体膜电位的改变[6]。

1.2.6细胞周期进程检测 取对数生长期的K562及K562/G01细胞，不同浓度的FM-Nov17处理48 h；1 000 r/min，5 min收集并洗涤细胞离心；75%冰冷的乙醇-20 ℃固定24 h；1 000 r/min离心5 min，弃去乙醇；含50 μg/mL RNA酶和50 μg/mL PI的PBS重悬细胞，室温避光孵育30 min，流式细胞仪检测；结果采用Modifit软件分析。

1.2.7细胞凋亡率检测 取对数生长期的K562和K562/G01细胞，不同浓度的FM-Nov17处理48 h，1 000 r/min离心5 min收集和洗涤细胞2次，用分别含有5 μL Annxin V-FITC和5 μL PI 的Binding Buffer避光孵育15 min，流式细胞仪检测。

1.2.8蛋白免疫印迹 取对数生长期的K562和K562/G01细胞，不同浓度的FM-Nov17处理48 h，裂解细胞提取总蛋白，BCA蛋白定量，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，封闭，相应一抗过夜孵育，TBST洗涤3次，每次10 min，二抗室温下孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min，用ECL超强发光底物在成像系统进行曝光显影。

2 结 果

2.1FM-Nov17体外抑制K562和K562/G01细胞增殖和减少增殖分裂代数 MTT实验结果表明,FM-Nov17和Nov都能够明显抑制细胞的增殖，FM-Nov17对K562和K562/G01细胞IC50分别为(58.28±0.31)和(62.36±0.14)μmol/L，而Nov对K562和K562/G01细胞IC50分别为(445.60±0.17)和(501.21±0.22)μmol/L(图1)。

A:FM-Nov17； B：Nov.

不同浓度的FM-Nov17处理K562和K562/G01细胞72 h后， K562和K562/G01细胞的增殖分裂代数减少(图2)。

2.2FM-Nov17诱导DNA的损伤 FM-Nov17处理细胞后， γ-H2AX发生磷酸化并聚集在DNA损伤处，流式细胞术检测γ-H2AX百分比增加,并且呈剂量依赖关系。与此同时,凋亡标志Cleaved-Parp的百分比也提高(图3)。

A:K562细胞；B：K562/G01细胞. a、b分别为FM-Nov17 75,37.5 μmol/L, c:对照组.

A：流式细胞术检测FM-Nov17诱导K562和K562/G01细胞DNA的损伤；B：FM-Nov17影响K562和K562/G01细胞内γ-H2AX表达；C：FM-Nov17诱导K562和K562/G01细胞内Parp的切割. 1.对照组； 2.FM-Nov17 37.5 μmol/L; 3.FM-Nov17 75 μmol/L. 与对照组比较，☆：P≤0.05；☆☆：P≤0.01；☆☆☆：P≤0.001.

2.3FM-Nov17影响K562和K562/G01细胞线粒体的膜电位 随着FM-Nov17药物浓度的增加，JC-1 Red/Green的比值减小，表明FM-Nov17能够诱导线粒体膜电位的降低(图4)。

2.4FM-Nov17诱导K562和K562/G01细胞凋亡 不同浓度的FM-Nov17处理K562和K562/G01细胞48 h，PI和Annexin V-FITC双染流式细胞术检测细胞凋亡结果表明，随着FM-Nov17药物浓度的增加，K562和K562/G01细胞的凋亡率随之增加(图5)。

2.5FM-Nov17诱导K562和K562/G01细胞周期G2/M期阻滞 不同浓度的FM-Nov17处理K562和K562/G01细胞48 h，PI染色流式细胞术检测细胞周期，结果表明，随着FM-Nov17药物浓度的增加G2/M期K562和K562/G01细胞比例明显增加(图6)。

A：流式细胞术检测FM-Nov17对线粒体膜电位的影响；B：柱状图描述FM-Nov17对线粒体膜电位的影响. 1. 对照组；2. FM-Nov17 37.5 μmol/L；3. FM-Nov17 75 μmol/L. 与对照组比较，☆☆☆：P≤0.0001.

A:流式细胞术检测FM-Nov17增加K562和K562/G01细胞凋亡；B：柱状图定量描述FM-Nov17对细胞凋亡率影响. 1.对照组； 2.FM-Nov17 37.5 μmol/L; 3.FM-Nov17 75 μmol/L. 与对照组比较，☆☆☆：P≤0.001.

2.6FM-Nov17影响K562及K562/G01细胞蛋白表达 不同浓度的FM-Nov17处理K562和K562/G01细胞48 h，蛋白免疫印迹结果表明,Nov能显著增加γ-H2AX、ATM、p-P53的表达以及Parp和Caspase 3的切割，而降低CDC25A和CDC25C的表达(图7)。

3 讨 论

CML是一种骨髓造血干细胞异常克隆性疾病[7]，以BCR-ABL嵌合染色体为主要特征，BCR-ABL的基因产物为具有酪氨酸激酶活性的P210蛋白。IM是以P210为治疗靶点的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)[8]，是治疗CML的一线药物，能明显缓解CML的临床症状，甚至在血液学和遗传学方面达到完全缓解CML[9]。但IM对于CML急性期和急变期以及BCR-ABL突变的CML患者疗效差，并且随着IM的临床使用，耐IM的病例不断增加。解决以上问题的方法大体有两种：其一，开发新的活性更高的TKI；其二，研发新的、非靶向BCR-ABL的抗肿瘤化合物。

临床现今常用的放疗和化疗方法，大多数以诱导肿瘤细胞DNA损伤为机制，细胞遭受DNA损伤时，会激活DNA损伤反应[10]，针对不同的损伤形式，激活不同的修复通路，如细胞受到轻微的DNA单个碱基的损伤便会激活碱基切除修复，当细胞遭受严重DNA双链断裂损伤(DSB)时便激活同源重组(HR)修复或非同源末端链接(NHEJ)修复[11]。在细胞出现DSB时，组蛋白γ-H2AX磷酸化聚集到DSB断裂处，招募其他DNA损伤修复蛋白如ATM、Chk1和Chk2等，ATM磷酸化而活化激活下游信号通路，如磷酸化P53能使抑制P53泛素化降解增强P53蛋白的功能[12]，磷酸化的Chk1和Chk2通过磷酸化P53稳定和增强P53的功能[13]，影响细胞的正常代谢活动甚至激活细胞程序性死亡(细胞凋亡)。P53通过抑制下游的CDC25A和CDC25C的表达，抑制有丝分裂促进因子(MPF)复合物的形成[14]，使细胞不能顺利通过G2/M期，诱导细胞周期G2/M期阻滞。P53也可以通过激活Bax介导的线粒体膜电位的降低，使细胞内的细胞色素C释放，激活Caspase信号通路，促使Parp和Caspase 3切割，使Parp修复功能丧失抑制DNA损伤修复以及激活线粒体凋亡通路，诱导细胞凋亡[15]。

图6 FM-Nov17影响K562和K562/G01细胞周期进程

图7 FM-Nov17影响K562和K562/G01细胞内DNA损伤相关蛋白的表达

Nov具有抑制CML细胞的增殖作用，但活性偏低，FM-Nov17是Nov的衍生物，由本课题组合成，通过体外抗肿瘤活性筛选即MTT实验表明，FM-Nov17也具有明显的抗CML的增殖作用，其活性比Nov提高了4倍左右。CFSE是一种低毒并能穿透细胞膜的荧光染料，在细胞分裂增殖过程中，标记荧光可平均分配至子代细胞中，荧光强度随细胞的分裂而降低，可用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等情况。CFSE实验表明，FM-Nov17能够减少CML细胞的增殖代数。进一步研究表明，FM-Nov17能够诱导CML细胞DNA损伤激活DNA损伤应答反应，增加p53的磷酸化，激活p53介导的细胞周期G2/M期阻滞和细胞凋亡，从而抑制CML的增殖。

综上所述，新生霉素衍生物FM-Nov17体外具有明显的抗CML活性，其机制为诱导DNA损伤触发细胞周期阻滞和细胞凋亡。

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