溶菌酶、Nisin、壳聚糖复合保鲜剂对冰鲜银鲳保鲜效果的研究

张璟晶，唐劲松，王海波，管远红

（江苏农牧科技职业学院食品科技学院，江苏泰州225300）

溶菌酶、Nisin、壳聚糖复合保鲜剂对冰鲜银鲳保鲜效果的研究

张璟晶，唐劲松，王海波，管远红

（江苏农牧科技职业学院食品科技学院，江苏泰州225300）

在单一生物保鲜剂实验研究的基础上，通过三因素三水平的L9（33）正交实验，将溶菌酶、壳聚糖和Nisin进行复配，以细菌总数和挥发性盐基氮（TVB-N）作为评价指标，评定冰鲜鲳鱼的品质变化，以确定保鲜效果最佳的复合型生物保鲜剂。结果表明：溶菌酶0.4g/L、壳聚糖5g/L、Nisin 0.4g/L为复合保鲜剂的最佳配比。经过最佳配比复合保鲜剂浸泡的银鲳鱼，其感官评分、细菌总数、TVB-N、硫代巴比总酸（TBA）值均优于对照组，在冷藏条件下能使银鲳的一级长2～3d，二级鲜度延长6～7d。

溶菌酶，复合保鲜剂，银鲳鱼

银鲳属鲈形目鲳亚目鲳科鲳属，因其肉质细嫩鲜美，富含高蛋白、不饱和脂肪酸和多种微量元素，具有较高的营养和保健价值[1]，但鲳鱼也容易受到微生物污染而导致腐败变质。国内外现在对于水产品的保鲜更趋向于不同来源的保鲜剂综合不同运用方法，发挥其协同效应，不仅可以增强其抑菌效果，而且可以降低单一防腐剂的使用量，从而减少其对食品品质的影响，提高其应用的安全性[2]。Nisin[3-4]和溶菌酶[5]均是应用十分广泛的天然防腐剂，且有研究表明二者混合使用能增强抑菌效果。壳聚糖[6]是甲壳素的脱乙酰化产物，具有良好的成膜特性、较强的抗菌保鲜防腐能力及良好的保湿性且易于生物降解。蓝蔚青、谢晶等[7]研究了冷藏条件下，溶菌酶结合壳聚糖、茶多酚复配保鲜剂使用使带鱼的货架期延长10d。而郭良辉等[8]研究了冷藏条件下用Nisin与溶菌酶等几种复合生物保鲜剂对蚌肉的保鲜，可使其保鲜期延长1倍。王秀娟等[9]在壳聚糖涂膜液中加入Nisin和VC对虾进行涂膜处理，效果明显优于未经涂膜的对照组，且有添加剂的效果更明显。目前对生物保鲜剂应用于水产品中有较多报道，但在银鲳中的应用还缺乏相关的报道。

本实验在单一生物保鲜剂研究的基础上，采用L9（33）正交实验，将溶菌酶、壳聚糖和Nisin三种保鲜剂进行复配，通过分析感官指标、细菌总数、TVB-N值等鲜度指标的变化，评价对冰鲜银鲳的保鲜效果，为其货架期的延长提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

银鲳鱼 购于农贸市场，冰鲜保藏；溶菌酶 上海源聚生物科技有限公司，20000U/mg；Nisin 兰州伟日生物工程有限公司食品级，活力单位≥1200U/g；壳聚糖 上海源聚生物科技有限公司，脱乙酰度＞95%；平板计数培养基 北京陆桥技术有限责任公司；硫代巴比妥酸 国药集团化学试剂有限公司；乙醇、无水碳酸钠、氢氧化钠、氯化钾、氧化镁等 均为分析纯。

SW-CJ-ZFD型超净工作台 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LDZX-30FA型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；722型可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；EL-20K型pH计 梅特勒-托多利仪器（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 试样处理方法 取冰鲜银鲳鱼，去除鱼头、鱼尾、内脏，沿背骨剖取鱼肉，分切成质量为200g的鱼片，流水洗净后晾干，浸渍于不同配比的保鲜液中，浸泡30s，捞出沥干，用薄膜袋分装，放入冰箱于（0±1）℃冷藏。

1.2.2 复合保鲜液配比优选 根据GB 2760-2007食品添加剂使用卫生标准，3种生物保鲜剂在水产品中的最大允许用量为：溶菌酶0.5g/L，壳聚糖6.0g/L，Nisin 0.5g/L。在单一生物保鲜剂对冷藏鲳鱼实验基础上，选择溶菌酶、壳聚糖、Nisin的取值水平分别为0.3～0.5、3.0～5.0、0.3～0.5g/L，采用L9（33）正交实验优选复合保鲜液配比，保存5d后测定其TVB-N和细菌总数值。实验设计方案如表1所示。

表1 复合保鲜剂配比正交实验因素水平表Table.1 Design of compound preservatives orthogonal experiment

1.2.3 复合保鲜液的保鲜效果测定 通过正交实验，得出最佳配比的复合保鲜剂。将鱼片随机分成两组，分别在保鲜液（保鲜组）和无菌蒸馏水（对照组）中浸泡30s，捞出沥干薄膜袋分装，于（0±1）℃冷藏。保藏期间，隔天取样测定细菌总数、TVB-N值、TBA值并进行感官评分。

1.2.4 鱼肉鲜度检测方法

1.2.4.1 感官检测 由10人组成评定小组，分别从鱼肉的气味、色泽、肌肉弹性、组织形态、弹性等指标进行评定，参考海水鱼感官评定方法SC/T 3103-2010《鲜冻鲳鱼》标准[10]，并给出各自综合评分。水煮实验：将水煮沸将鱼块放入，加盖，煮5min后开盖，立即闻气味，然后品尝鱼肉。具体评定标准如表2所示。每项指标记分标准按以下五个等级来进行打分，取其平均值。

1.2.4.2 挥发性盐基氮（TVB-N值）的测定 采用GB/T 5009-2008中《半微量定氮法》进行测定。依据规定[10]：TVB-N值（mg/100g）≤18时，为一级品，TVBN值（mg/100g）≤30时，为二级品。

1.2.4.3 细菌总数的测定 在无菌操作台内，称取10.00g绞碎的鲳鱼肉置于90mL无菌生理盐水中，按GB 4789.2-2010《食品微生物学检验菌落总数测定》的方法操作。每个稀释度作2次平行，以无菌生理盐水为空白作对照实验，结果以CFU/g表示。

依据规定[10]：银鲳鱼细菌总数≤104CFU/g为一级品；细菌总数≤107CFU/g为二级品。

1.2.4.4 TBA值的测定 准确称取绞碎的鲳鱼肉10.00g置于三角瓶中，加入50mL 7.5%的三氯乙酸溶液（含0.1%EDTA），振摇30min，双层滤纸过滤两次。取5mL上清液，加入5mL硫代巴比妥酸溶液（TBA，0.02mol/L），沸水浴40min，取出冷却1h后离心5min（1600r/min），上清液中加5mL氯仿摇匀，静置分层后取上清液分别在532nm和600nm处比色，记录吸光值并用以下公式计算。与TBA反应的物质的量以每100g肉中丙二醛的mg数来表示[11]。

TBA值（mg/100g）=（A532-A600）/155×（1/10）×72.6×100

表2 鲳鱼感官评定表Table.2 Sensory evaluation of pomfret

2 结果与分析

2.1 复合保鲜液配比优选正交实验结果

从表3、表4中可以看出：溶菌酶对冷藏鲳鱼TVB-N含量的影响效果显著，壳聚糖和Nisin影响效果不显著；溶菌酶和壳聚糖对细菌总数的影响效果显著，Nisin的影响效果不显著。各因素对冷藏鲳鱼TVB-N含量和细菌总数的影响主次顺序为A＞B＞C，即溶菌酶用量＞壳聚糖用量＞Nisin用量。复配组合A3B3C2，对于抑制细菌总数的增加效果是最好的；组合A2B2C3、A2B3C3分别为减缓TVB-N增加的实际最优组合和理论最优组合，从方差分析可以看出，因素A溶菌酶在减缓TVB-N方面达到了显著水平，因素B对细菌总数影响显著，而因素C对于两个指标的影响均不显著，所以最终选择A2B3C2为最佳配比，即溶菌酶浓度为0.4g/L，壳聚糖浓度为5g/L，Nisin浓度为0.4g/L。

表3 复合保鲜剂最佳比例正交实验结果Table.3 Results of pomfert fresh-keeping orthogonal experiment

2.2 复合保鲜液对冰鲜银鲳保鲜效果

2.2.1 鱼肉感官评分结果 由图1可知，在整个贮藏过程中，鲳鱼肉的新鲜度感官评分值逐渐下降，对照组下降明显快于保鲜组。对照组和保鲜组的样品的初始感官评分都为10分，在第4d时，对照组的分值已经明显低于保鲜组，在第8d时对照组已腐败严重，体表色泽暗淡，肉质松软，切面无光泽，并伴随着较大的臭味，而保鲜组在冷藏了8d时，还能保持固有光泽与弹性，可见，复合保鲜剂能显著延长冷藏鲳鱼的保鲜期，通过涂膜处理在鱼体表面形成一层膜，能有效地隔绝外界的空气和水，阻止微生物的进一步侵染繁殖，尤其是在复合保鲜剂本身抑菌杀菌作用的影响下，进一步改善了带鱼的感官品质，使其能够在较长时间内保持新鲜度。

图1 冷藏过程中银鲳鱼感官品质的变化Fig.1 Variations of sensory scores of pomfert during cold storage

2.2.2 复合保鲜剂对银鲳鱼TVB-N值的影响 TVB-N是水产品在细菌和酶的作用下分解产生氨及低级胺类化合物，常测定其总氮量作为鱼类的鲜度指标。根据SC/T3103-2010《鲜冻鲳鱼》[10]标准，TVB-N值（mg/ 100g）≤18时，为一级品，TVB-N值（mg/100g）≤30时，为二级品。

图2 冷藏过程中银鲳鱼TVBN值的变化Fig.2 Variations of TVB-N values of pomfret during cold storage

由于银鲳中不饱和脂肪酸易氧化，可溶性蛋白质以及水分含量较高，微生物易繁殖，分解蛋白产生氨、胺类碱性物质，TVB-N含量随之升高。由图2中可以看出，复合保鲜剂组的TVB-N含量低于空白实验组，货架期得到了延长。在保鲜的第9d，对照组的TVB-N值已达到41.967mg/100g，已经超出二级鲜度的指标，而复合保鲜剂组的TVB-N值是10.395mg/100g，仍在一级鲜度内。可见，复合保鲜剂能抑制使蛋白质分解程度大大减小，从而使TVB-N增长幅度明显小于对照组。

2.2.3 复合保鲜剂对银鲳鱼细菌总数的影响 银鲳鱼在捕捞、运输、销售过程中都会被微生物污染，尤其银鲳鱼在死后的腐败变质，主要因为细菌的繁殖所导致，因此测定细菌总数可以判断银鲳鱼的鲜度和腐败程度。依据SC/T3103-2010《鲜冻鲳鱼》[10]标准规定：银鲳鱼细菌总数≤104cfu/g为一级品；细菌总数≤107CFU/g为二级品。

表4 正交实验结果的方差分析Table.4 Variance analysis of pomfert fresh-keeping orthogonal experiment

由图3可看出，对照组在第3d所测得的细菌总数的对数值达到了4.79（6.2×104cfu/g），超过了一级鲜度的要求；保鲜组在第3d时细菌总数对数值为3.59（3.9×103cfu/g），还在一级鲜度范围内，在第5d时细菌总数值1.1×105cfu/g，超过一级鲜度范围。对照组在第5d时，细菌总数已超过二级鲜度最高限，而保鲜组在第9d时细菌总数对数值为6.26（1.8×106cfu/g），仍维持在二级鲜度范围内。溶菌酶复合保鲜剂在冷藏初期能抑制银鲳鱼中细菌总数的增加，究其原因为保鲜剂（溶菌酶、壳聚糖等）具有抑菌和杀菌的作用，复合保鲜剂使冰鲜银鲳在一级品范围内延长2～3d，二级品延长6～7d。

图3 冷藏过程中银鲳鱼细菌总数的变化Fig.3 Variations of total bacterial count of pomfret during cold storage

2.2.4 复合保鲜剂对其TBA值的影响 在图4中可以看出，对照组的TBA值在初期趋于平缓，而在3d后快速上升，复合保鲜剂组的银鲳鱼TBA值都较缓慢的上升，在冷藏过程中，对照组的银鲳鱼TBA值在第9d时达7.62mg/100g，而复合保鲜剂组的TBA值才为4.29mg/100g。这是由于保鲜剂壳聚糖有一定成膜性，在鱼体表面形成一层透明的薄膜，阻止外界氧气进入，减缓脂肪氧化的进行，而具有杀菌作用的溶菌酶和Nisin的添加，使复合保鲜剂在协同作用下延缓了TBA含量的增高，延长了存放期限。

图4 冷藏过程中银鲳鱼TBA的变化Fig.4 Variations of TBA values of pomfret during cold storage

3 结论

通过正交实验，结果表明，最佳复合保鲜剂的组合为溶菌酶为0.4g/L，壳聚糖的浓度为5g/L，Nisin的浓度为0.4g/L。经最佳配比复合保鲜剂处理过的银鲳鱼在冷藏保鲜过程中感官评分值下降缓慢，其TVBN值、细菌总数和TBA值均明显低于对照组。研究发现溶菌酶复合保鲜组能将银鲳鱼的一级鲜度延长2～3d，二级鲜度延长6～7d，复合保鲜剂处理银鲳鱼后再进行冷藏保鲜可以更有效地抑制细菌繁殖，延缓腐败变质，从而延长银鲳鱼的保鲜期，这也表明溶菌酶复合保鲜剂浸泡保鲜是一种有应用前景的保鲜方法。

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The combined use of lysozyme，nisin and chitosan for the preservation of iced pomfret

ZHANG Jing-jing，TANG Jin-song，WANG Hai-bo，GUAN Yuan-hong
（Department of Food Science and Technology，Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College，Taizhou 225300，China）

On the base of the research of single biological preservative，the orthogonal experiment was made to investigate the fresh-keeping effect of complex biological preservatives（a miture of lysozyme，nisin and chitosan）in the preservation of pomfret under the cold storage.The total bacterial count，TVB-N were used to evaluate its quality.According to the results of orthogonal experiment L9（33），the best concentrations of lysozyme，chitosan，and Nisin were as follows 0.4，5，0.4g/L.The sensory scores，total bacterial count，TVB-N and TBA of pomfret treated by the complex biological preservatives were better than uncoated one.The first grade freshness of pomfret treated by the complex biological preservatives could be extended 2～3 days，and the two grade freshness could be extended 6～7 days.

lysozyme；complex preservative；pomfret

S983.04

A

1002-0306（2014）04-0323-04

2013－06－21

张璟晶（1981-）女，硕士研究生，主要从事食品营养与检测方面的研究。

泰州市科技发展计划（指导）项目（2011019）。