不同胎次奶牛乳中乳蛋白含量的近红外光谱定量分析

李双红，刘永峰，韩裕睿，赵露华，袁 爽

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062）

不同胎次奶牛乳中乳蛋白含量的近红外光谱定量分析

李双红，刘永峰*，韩裕睿，赵露华，袁 爽

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062）

对不同胎次奶牛的牛奶样品进行近红外光谱扫描，并用多功能乳制品分析仪对牛奶样品中蛋白质的含量进行测定。利用正交实验设计，分别采用主成分回归法（PCR）、偏最小二乘法（PLS）、改进偏最小二乘法（MPLS）三种定量校正方法和多种光谱预处理方法建立模型，利用目标函数法对模型进行评定，结果表明：一胎、二胎奶牛乳样中乳蛋白的最优模型相同，其校正相关系数（R2）、定标标准差（SEC）和预测标准差（SEP）分别为：0.9626、0.0531、0.0630和0.9377、0.0810、0.1100；建立了三胎及以上奶牛乳样中乳蛋白的最优模型，R2、SEC和SEP分别为：0.9406、0.0461和0.0500；同时，建立了所有乳样中乳蛋白的最优模型，R2、SEC和SEP分别为：0.9351、0.0687和0.0790。所建模型对于快速、准确、无损、定量检测原料奶中乳蛋白的含量是可行的，该方法为快速检测混合原料奶中乳蛋白含量提供了理论依据。

乳蛋白，近红外光谱，定量分析，胎次

牛乳所含营养成分齐全，组成比例适宜，近年来已经成为人们饮食的重要组成部分[1]。牛乳的营养成分中，蛋白质的含量是衡量牛乳质量的核心指标之一。影响乳中的乳蛋白含量的因素很多，有奶牛胎次、品种、泌乳阶段、产奶量、饲养方式等。据报道，不同胎次奶牛乳样中乳蛋白含量明显不同[2]。熊本海等[3]研究了中国奶牛乳成分及相关指标随季节和胎次变化的规律。Moore等[4]研究了胎次与乳中免疫球蛋白的含量关系，发现奶牛三胎乳中免疫球蛋白含量高于一胎牛乳。Hagiwara等[5]研究发现一胎与二胎奶牛的乳铁蛋白含量差异不显著，而第三胎时乳铁蛋白含量显著下降（p＜0.05），且随着产犊的增加乳铁蛋白含量呈不断下降趋势。可见，对于原料奶中蛋白质含量的测定备受广大乳品企业关注。

目前原料乳及乳制品中的蛋白质主要是通过传统的化学方法测定，而像近红外光谱分析方法（NIRS）这类快速、准确、无损的检测技术应用较少，但其现实意义重大[6]。NIRS利用物质在近红外光谱区内的光学特性[7]，快速测定样品成分含量。虽然国内很多学者已将NIRS广泛运用于牛奶中主要成分含量的测定分析[8-11]。但是，将NIRS与正交实验设计相结合定量分析不同胎次奶牛乳中乳蛋白成分含量的研究还少见报道。因此，本研究借助近红外光谱技术，将正交实验设计用于研究不同的光谱预处理和定量校正过程中，分别建立不同胎次奶牛乳中乳蛋白的最优模型，并用验证集对模型进行验证，旨在提高模型的稳定性和预测能力，为快速、无损检测原料奶中蛋白质含量的研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛奶样品 均取自西安综合开发总公司畜牧开发公司奶牛场，所有牛乳样品用离心管采集，约为15mL，共270份，放入冰盒带回实验室。

MilkoScan FT120型多功能乳制品分析仪、Infraxact型多功能近红外光谱分析仪 均购自瑞典FOSS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 光谱采集 样品利用多功能近红外光谱仪对样品进行光谱扫描。配制硅（570～1100nm）和铟镓砷（1100～1850nm）做为检测器，工作温度0～40℃，测定谱区范围570～1850nm，采样间隔为2nm，每个样本重复扫描3次，取平均值。保持实验环境的温度为20～25℃、湿度为40%～60%。采用仪器配套的化学计量软件WinISI III来进行定标和模型的验证。

1.2.2 乳样中蛋白质的实际测定 利用多功能乳制品分析仪测定乳样中乳蛋白的实际含量。

1.2.3 异常样本剔除及样本集的划分 采用马氏距离（GH=3）方法处理[12]，将马氏距离大于3.0的样品被认定为异常样品，被剔除。剩余样本基本采用了“隔四选一”或“隔六选一”法分为定标集和验证集。

1.2.4 定标模型建立

1.2.4.1 光谱预处理方式及定量校正方法 本实验在建立模型之前对原始光谱进行了预处理[13]，减少了样品的状态、光的散射、杂散光及仪器的响应等因素的影响。主要采用的光谱预处理方式为：散射校正（None：无散射处理，SNV+D：标准正常化+趋势变化法散射处理，MSC：多元散射校正）、导数处理（0阶导、1阶导、2阶导）、平滑处理和二次平滑处理。采用的定量校正方法为：主成分回归法（principle component regression，PCR）、偏最小二乘法（partial least square， PLS）、改进偏最小二乘法（modified partial least square，MPLS）。

1.2.4.2 定标模型优化 本实验采用实验优化设计的思路，将不同的处理或参数设置设计成正交实验[14]。将6种不同的处理设定为6个因素，每个因素取3个水平，选取L27（313）正交表中第1、2、4、8、11、13列进行实验安排，见表1。

表1 正交实验设计因素水平表Table.1 Factor and levels of orthogonal test

1.2.4.3 模型优劣评价方法 本研究采用李君霞等[14]提供的目标函数法进行模型的优劣评价。目标函数法是模型的两个重要参数的函数（定标决定系数和交叉验证标准差），以目标函数值f（x）=R/（1+SECV）[13]来评估模型的预测性能。

1.2.5 模型的验证 模型建好后，本实验用验证集来检验模型好坏，分别用不同胎次奶牛牛奶样品中未参与定标的验证样本对建好的最优模型进行检验。并通过相关指标如偏差（Bias）、标准差、相关系数等来评价模型的预测准确性。

2 结果与分析

2.1 近红外光谱采集结果

不同胎次乳样的光谱采集结果见图1，经标准正常化+趋势变化法散射处理、二阶导数处理、平滑和二次平滑处理后的光谱采集结果见图2。

2.2 样品集的划分结果

图1 原料奶的近红外光谱图Fig.1 Near infrared spectrograms of raw milk samples

总样品为270个，共剔除了异常样本38个，剩余232个。其中：一胎奶牛乳样145个，剔除异常样本26个；二胎奶牛乳样53个，剔除异常样本4个；三胎及三胎以上奶牛乳样72个，剔除异常样本8个。样品集经剔除异常样本后，结果如表2所示，可见四种不同分组中验证集的最大值和最小值均在定标集的空间范围内，说明定标集和验证集分布较为合理，均匀，具有很好的代表性。符合建立近红外光谱分析模型的要求[15-16]。

图2 经标准正常化+趋势变化法散射处理、二阶导数处理、平滑和二次平滑处理后的光谱图Fig.2 Near infrared spectrograms of raw milk samples by the processing of standard normalization and trends method scattering，the second derivative processing，smoothing and secondary smoothing

2.3 正交实验结果

正交实验的结果，见表3。一胎和二胎奶牛牛奶样品的最佳因素组合均为A3B2C2D3E2F3，即定标校正方法为MPLS，散射校正为SNV+D，导数处理为1阶，导数处理间隔点数为8，平滑处理间隔点数为4，二次平滑处理间隔点数为8。三胎及三胎以上奶牛样品的最佳因素组合为A2B2C3D3E3F1，即定标校正方法为PLS，散射校正为SNV+D，导数处理为2阶，导数处理间隔点数为8，平滑处理间隔点数为8，二次平滑处理间隔点数为1。所有胎次奶牛样品的最佳因素组合为A2B2C2D1E2F3，即定标校正方法为PLS，散射校正为SNV+D，导数处理为1阶，导数处理间隔点数为1，平滑处理间隔点数为4，二次平滑处理间隔点数为8。

表2 样品分集结果Table.2 Diversity results of samples

表3 正交实验结果Table.3 Results of orthogonal test

在各因素中，定标校正方法和散射处理方式对模型优劣的影响较为突出。

续表

2.4 最优模型评价指标的确定

对于正交实验的结果，要有定量的指标来评价模型的优劣，在WinISI III软件得到的定标结果中，有以下相关指标：相关系数（calibration coefficient of correlations，R2）用于考察预测值与实际值之间的相关程度；定标标准差（standard error of calibration，SEC）、交叉验证标准差（standard error of cross-validation，SECV）用于评价所建模型对内部样本的预测能力。从表4中结果可以看出，不同胎次奶牛牛奶样品中参与定标的样品的实验室数据和近红外预测数据之间的SEC值均比较低，分别为0.0531、0.0810、0.0461和0.0687。近红外预测数据和实验室标准数据间的R2值很高，分别为0.9626、0.9377、0.9406和0.9351。定标建模过程中，进行交叉验证计算时所获得的近红外预测值与实验测定值的SECV也很低，分别为0.0641、0.1116、0.0584、0.0803。定标建模过程中，进行交叉验证计算时所得的相关系数，即模型对样品及浓度变化所能描述出的百分数（1-VR）较高，可达0.9455、 0.8839、0.9067、0.9119，同时目标函数F最低值为87.5%，F值越高，模型的预测性能越好。

表4 最优模型评价指标参数Table.4 The result of evaluation index parameters of optimal models

2.5 模型的验证结果

用验证集对建好的模型进行验证来评价模型的稳定性和预测能力，结果见表5。其评价指标有预测标准差（standard error of performance，SEP）用于评价模型对外部样本的预测能力、相对标准差（relative standard deviation，RSD）、相对分析误差（relative prediction deviation，RPD）。本实验用RSD和RPD来验证模型的稳定性和预测能力。一般情况下，当RSD＜10%，模型可用于实际的检测；当RPD＞3，则模型具有良好的稳定性和较高的预测能力[17-19]。

表5 最优模型验证结果Table.5 Validation results of optimal models

由表5可看出，所有胎次奶牛乳中乳蛋白的R2值均达到87%以上，说明实际测定值和光谱预测值之间具有良好的线性关系。同时SEP值比较小，说明模型预测的准确性比较高，且所有胎次的RSD＜10%，RPD＞3，说明建好的模型性能良好，预测精度高。预测结果和实际测定值很接近，因此，本研究通过近红外光谱分析技术与正交实验设计相结合建立的模型适于所有原料奶中蛋白质含量的测定。

所有胎次奶牛的乳中乳蛋白含量用多功能乳制品分析仪测出的真实值和近红外光谱法预测值的线性相关图分别如图所示（图3～图6）。

图3 一胎奶牛牛乳中乳蛋白含量实际测定值与近红外预测值线性相关图Fig.3 Linear correlation between actual measurements value and NIR predicted value with the milk protein content in the first parities cows

图4 二胎奶牛牛乳中乳蛋白含量实际测定值与近红外预测值线性相关图Fig.4 Linear correlation between actual measurements value and NIR predicted value with the milk protein content in the second parities cows

图5 三胎及三胎以上奶牛牛乳中乳蛋白含量实际测定值与近红外预测值线性相关图Fig.5 Linear correlation between actual measurements value and NIR predicted value with the milk protein content in the third and more times parities cows

图6 所有胎次奶牛牛乳中乳蛋白含量实际测定值与近红外预测值线性相关图Fig.6 Linear correlation between actual measurements value and NIR predicted value with the milk protein content in all cows

3 结论与讨论

近红外光谱分析作为一种有效的分析手段，在乳成分定量分析和质量监测方面得到了广泛应用，李庆波等[20]研究了采用近红外光谱技术检测牛奶中主要成分含量的方法。讨论采用偏最小二乘法建立校正模型过程中数字滤波预处理方法以及利用遗传算法优选波段。王云等[21]研究了近红外光谱法在牛奶主要成分分析中的应用，重点对比不同近红外区域的检测结果。利用偏最小二乘法建立校正模型，探讨了不同光谱区域和数据预处理对模型准确性的影响。郑丽敏等[22]采用傅里叶变换近红外光谱法，快速测定了新疆疆岳驴奶中脂肪、蛋白质、能量和灰分的含量。韩东海等[23]利用红外光谱技术无损、快速、准确的实现了纯牛奶中还原奶的鉴别和原料奶新鲜度的判别。不同胎次的奶牛的乳蛋白含量不同，而本实验是对不同胎次奶牛乳中蛋白质含量进行直接研究，并分别建立了最优模型，为快速测定不同胎次奶牛的蛋白质含量提供了方法。原料奶出售的价格在很大程度上取决于奶中乳蛋白含量的高低，因此，本实验的研究对于原料奶按质论价具有重要的指导意义。

本实验利用近红外光谱技术研究了不同胎次奶牛所产的牛乳中的蛋白质的含量，结合正交实验设计研究了基于不同的光谱预处理方式和定标校正方法建立的不同的定量分析模型，并通过目标函数值评定出了最优模型，然后通过未参与定标的验证集样本对最优模型的性能进行验证。采用R2、SEC、SEP三个参数来评价模型的稳定性和预测能力。最终建立了一胎、二胎、三胎及以上和所有胎次奶牛乳样的模型，它们的预测值与实际值的相关程度较高，而且模型的预测准确性较高。因此，本研究所建模型性能良好，可以用于实际预测。

[1]吴定，高云.食品营养与卫生保健[M].北京：中国计量出版社，2008（2）：146.

[2]王俊峰，王中华，梁国义，等.影响奶牛乳蛋白质含量的因素及营养调控技术研究[J].饲料工业，2006（15）：48-53.

[3]熊本海，易渺，扬琴，等.中国北方荷斯坦奶牛乳成分及相关指标的季节性与胎次变化规律的研究[J].畜牧兽医学报，2013（1）：31-37.

[4]Moore M，Tyler JW，Chigerwe M，et al.Effect of delayed colostrum collection on colostral IgG concentration in dairy cows [J].Journal of The American Veterinary Medical Association，2005，226（8）：1375-1377.

[5]Hagiwara S，Kawai K，Anri A，et al.Lactoferrin concentrations in milk from normal and subclinical mastitic cows[J].Journal of Veterinary Medical Science，2003，65（3）：319-323.

[6]张华秀，李晓宁，范伟，等.近红外光谱技术在液态奶脂肪与蛋白质含量检测中的应用[C].第十届全国计算（机）化学学术会议论文摘要集，2009.

[7]陆婉珍，袁洪福，徐广通，等.现代级红外光谱分析技术[M].北京：中国石油化工出版社，2000.

[8]李亮，丁武.近红外光谱技术在牛奶及其制品分析中的应用进展[J].中国奶牛，2009，16：46-48.

[9]陆辉山，应义斌，刘燕德.近红外光谱技术在牛奶及乳制品分析中的应用研究[J].农业工程学报，2003，19：205-210.

[10]曹佳，赵武奇，魏振东.掺假羊奶原奶中植物蛋白的近红外快速检测[J].农产品加工·学刊，2012（3）：131-133.

[11]董一威，屠振华，朱大洲，等.利用近红外光谱快速检测牛奶中三聚氰胺的可行性研究[J].光谱学与光谱分析，2009（11）：34-38.

[12]张华秀.近红外光谱法快速检测牛奶中蛋白质与脂肪含量[D].长沙：中南大学，2010.

[13]王硕.近红外光谱分析中牛奶模型优化方法的初步研究[D].天津：天津大学，2005.

[14]李君霞，闵顺耕，张洪亮，等.水稻糙米粗蛋白近红外光谱定量分析模型的优化研究[J].光谱学与光谱分析，2006（5）：833-837.

[15]谷月，赵武奇，李晓丹，等.近红外光谱技术对液态奶制品中乳糖、脂肪及蛋白质的定量检测[J].宁夏大学学报：自然科学版，2012，33：377-380.

[16]Prieto N，Dugan MER，López-Campos O，et al.Near infrared reflectance spectroscopy predicts the content of polyunsaturated fatty acids and biohydrogenation products in the subcutaneous fat of beef cows fed flaxseed[J].Meat Science，2011（1）：43-51.

[17]吴静珠，王一鸣，张小超，等.基于近红外的奶粉品质检测技术研究[J].光谱学与光谱分析，2007（9）：35-38.

[18]Prieto N，Ross DW，Navajas，EA，et al.Online prediction of fatty acid profiles in crossbred Limousin and Aberdeen Angus beef cattle using near infrared reflectance spectroscopy[J]. International Journal of Animal Bioscience，2011（1）：37-42.

[19]祝诗平，王刚，杨飞，等.粉末样品颗粒大小对花椒挥发油近红外光谱定量预测的影响研究[J].光谱学与光谱分析，2008（4）：775-779.

[20]李庆波，徐可欣，王斌.牛奶主要成分含量近红外光谱快速测量法[J].食品科学，2002，23（6）：121-122.

[21]王云，徐可欣，常敏.近红外光谱技术检测牛奶中脂肪及蛋白质含量校正模型的建立[J].光学仪器，2006，28（3）：3-7.

[22]郑丽敏，张录达，郭慧媛，等.近红外光谱波段优化选择在驴奶成分分析中的应用[J].光谱学与光谱分析，2007，27（11）：2224-2227.

[23]韩东海，鲁超，刘毅.纯牛奶、还原奶、掺假奶、牛奶新鲜的近红外检测[J].中国供销商情，2006（4）：39-41.

Quantitative analysis of milk protein content in different parities cows based on near infrared spectroscopy

LI Shuang-hong，LIU Yong-feng*，HAN Yu-rui，ZHAO Lu-hua，YUAN Shuang
（College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

In this experiment，spectrum of different parities milk samples were scanned using near-infrared spectrometer（NIRS），and the protein content in milk samples was measured using the multifunctional analyzer of dairy.The models were established through orthogonal design and validated with principle component regression（PCR），partial least square（PLS），modified PLS and a variety of pretreatment methods.Then，the models were evaluated by the objective function method.The result showed that the first parity samples share the same optimal model with the second parity samples in the milk protein And their calibration coefficient of correlations（R2），standard error of calibration（SEC）and standard error of prediction（SEP）were 0.9626，0.0531，0.0630 and 0.9377，0.0810，0.1100，respectively.The optimal model of the milk protein of the third parity samples and more times samples were established，and the R2，SEC and SEP of the optimal model were 0.9406，0.0461，0.0500.Meanwhile，the optimal model of all milk protein samples were also established，and the R2，SEC and SEP of the optimal model were 0.9351，0.0687，0.0790.Therefore，it was suitable for using these models to detect simulately the milk protein rapidly，accurately and non-destructively.The analysis method provided the theoretical basis for detecting the milk protein quickly in mixed raw milk.

milk protein；near infrared spectroscopy；quantitative analysis；parity

TS252.1

A

1002-0306（2014）04-0060-06

2013－07－30 *通讯联系人

李双红（1992-），女，大学本科，主要从事食品科学与安全方面的研究。

西安市科技计划项目（NC1208-2）；陕西省科技攻关项目（2012NY2-17）；国家大学生创新性实验计划课题（201210781126）。