化学发光免疫法检测食品中恩诺沙星残留的研究

龚云飞，邹晓楠，张露露，吴莹莹，戴明雁，陈宗伦，张明洲，*

（1.中国计量学院生命科学学院，浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，浙江杭州310018；2.杭州迪恩科技有限公司，浙江杭州310013）

化学发光免疫法检测食品中恩诺沙星残留的研究

龚云飞1，邹晓楠1，张露露1，吴莹莹1，戴明雁1，陈宗伦2，张明洲1，*

（1.中国计量学院生命科学学院，浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，浙江杭州310018；2.杭州迪恩科技有限公司，浙江杭州310013）

建立了基于多克隆抗体的化学发光免疫检测技术，用于测定动物源性食品中恩诺沙星残留含量。反应条件优化结果为：抗体包被最佳稀释倍数为64000倍，最佳酶标抗原稀释倍数为256000倍。结果显示：该方法的回归曲线方程为y=-13.898x+110.38（R2=0.9893），检测线性范围为3～810pg/mL，IC50为69.63pg/mL，IC10为1.41pg/mL；鸡肉、鱼肉、虾肉、蜂蜜、牛奶空白组织样品中恩诺沙星的最低检测限分别为3.76、4.59、2.85、2.65、4.20pg/mL，最低定量限分别为6.13、7.35、3.57、3.73和6.48pg/mL，回收率在88.28%～102.6%，板内和板间的平均变异系数分别为2.61%和4.71%。表明本研究建立的化学发光免疫检测方法满足动物源性食品恩诺沙星残留的检测要求。

恩诺沙星，化学发光免疫检测技术，食品安全

抗生素滥用是社会关注的热点问题，动物饲料中添加或者直接使用抗生素来预防和治疗感染，导致了动物源性产品中抗生素的大量残留。人类食用含有抗生素残留的食品，可导致抗生素在人体的富集[1]；同时可诱导细菌产生抗药性，如结核杆菌、痢疾病菌持续危害人类健康其原因就是耐药性升高[2]，临床上的病菌感染致死大多也与此有关；抗生素在人体内的代谢还可增加器官负担，增大对肝脏和肾脏的损害风险[3]，从而增加患恶性疾病的风险[4]。

恩诺沙星属于喹诺酮类抗生素，广泛用于预防治疗动物疾病[5]。但因其滥用，造成动物制品中恩诺沙星残留，并给人体健康带来威胁，如导致过敏反应与其他毒副作用[6-7]，造成头痛等神经系统不良反应[8]，引起胃部痉挛[9]，造成恶心与呕吐等消化系统不良反应[10]。因此，世界各国对喹诺酮类抗生素的最高残留限量（Maximum residue limits，MRLs）均做出了严格限制，如日本在2007年调整了水产品恩诺沙星残留限量标准欧盟，即鱼贝类恩诺沙星MRLs不得超过10μg/kg；我国及美国均规定，牛、羊的脂肪与肌肉、奶、肾、肝中的MRLs分别为100、100、200和300μg/kg[11]，猪、兔与家禽等其他动物的脂肪与肌肉、肝、肾中的MRL分别为100、200和300μg/kg[12]。

化学发光免疫检测方法结合了高灵敏度的化学发光检测技术与高特异性的免疫反应[13]，具有检测线性范围广[14]、灵敏度高[15]、检测时间短[16]等特点，相比高效液相、气质联用等检测方法，化学发光免疫简化了步骤、减少了操作时间，且不需要专业操作人员，更适用于基层检测。本文采用实验室前期制备的抗体，并自主合成酶标抗原，初步建立了直接竞争化学发光免疫分析法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

99%恩诺沙星 中国兽医药品监察所；96孔聚苯乙烯酶标板 美国CORNING-COSTAR公司；化学发光显色剂 湖州英创生物科技有限公司；1-乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS） 分析纯，上海生工生物技术有限公司；鸡肉、鲫鱼、虾、牛奶与蜂蜜样品 购自杭州市下沙物美超市和高沙菜场。

KPS-QQ80化学发光分析仪 北京泰格科信生物技术有限公司；HP1100高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；Multiskan Ascent酶标仪 美国Thermo Scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶标抗原的合成及与抗ENR抗体最佳工作浓度的确定 反应温度由37℃改为4℃，其他步骤和反应条件参照文献[17]中的ENR人工抗原合成方法合成ENR酶标抗原。

采用方阵法确定化学发光免疫检测法的抗ENR抗体与ENR-HRP的最适工作浓度。纯化抗体用包被液按1∶160000、1∶320000、1∶640000、1∶1280000进行梯度稀释，100μL/孔包被于96孔酶标板中，4℃包被24h，洗板拍干；封闭液300μL/孔，37℃条件下封闭2h，洗板拍干；先后添加入梯度浓度的ENR标准品（50μL/孔）和酶标抗原（100μL/孔），25℃反应10min，洗板拍干；加入混合好的化学发光显色剂（100μL/孔，A液∶B液为1∶1），立刻测定发光值。

1.2.2 ENR化学发光免疫检测方法（CLIA）基本操作步骤 将包被有E-4抗体的化学发光免疫酶标板于4℃取出，置25℃回温30min，每孔加入50μL的ENR标准品或者待检样品，平行重复实验3次；加入100μL酶标抗原，25℃反应10min；洗板四次，拍干；将化学发光底物显色剂加入酶标板，100μL/孔，于读数仪读数。

1.2.3 CLIA标准曲线制作与灵敏度分析 加系列浓度的ENR标准品溶液0、3、10、30、90、270、810pg/mL，50μL/孔，其他步骤同1.2.4，重复6次。以ENR标准品浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，制作半对数标准曲线，结合率I（%）=B/B0×100，并分别计算IC50和 IC10。以IC50衡量抗体对恩诺沙星的亲和性，以IC10衡量恩诺沙星化学发光免疫的检测灵敏度。

1.2.4 CLIA样品前处理方法

1.2.4.1 组织样品 准确称取3g匀浆的组织样品（鸡肉、鱼肉与虾肉），加入9mL提取液（0.1mol/L NaOH∶乙腈=1∶8）混匀提取10min，室温3000×g离心10min；取上清3mL，加入PBS 3mL、二氯甲烷8mL，充分混匀后室温3000×g离心10min；取下层液体2mL氮气吹干，加入1mL正己烷复溶后，加入一定体积的PBS振荡混匀（0.5mL，稀释倍数为2；1mL，稀释倍数为4；以此类推），室温3000×g离心10min后，取下层50μL待测，考察样品基质的影响并确定最佳稀释倍数。

1.2.4.2 牛奶样品 直接检测样品；或取适量样本用PBS按一定比例稀释（1∶1，则稀释倍数为2；1∶3，稀释倍数为4……依此类推），取50μL进行检测，并分析样品基质的影响以确定最佳稀释倍数。

1.2.4.3 蜂蜜样本 准确称取1g样品，加入一定体积的样品提取液（含30%乙醇的PBS缓冲液），振荡30min，于3000×g离心10min，取上清50μL进行分析样品基质的影响并确定最佳稀释倍数（1mL含30%乙醇的PBS，稀释倍数为2；3mL，稀释倍数为4；以此类推）。

1.2.5 精密度测定 测定计算同一包被时间和三个不同包被时间的试剂盒中的板内与板间的变异系数。在同一块板上重复10次建立标准曲线，测定OD450值并计算变异系数。

1.2.6 最低检测限与定量限分析 随机抽取经HPLC分析未检测出ENR的20份阴性样品，用本研究建立的化学发光免疫检测方法检测，计算最低检测限（LOD）=阴性样品ELISA检测平均值+3倍标准差（SD），最低定量限（LOQ）=阴性样品ELISA检测平均值+6倍标准差（SD）。

1.2.7 准确度分析 添加回收率（%）=测定的样品浓度/理论浓度×100。在鸡肉、鱼肉、虾肉、牛奶与蜂蜜阴性样品中分别添加ENR标准品，使其浓度达到50、100、1000pg/g（pg/mL），每个样品及添加浓度6次平行实验，计算平均添加回收率。

2 结果与分析

2.1 酶标抗原合成鉴定及与抗体最适工作浓度的确定

图1 酶标抗原ENR-HRP紫外扫描图Fig.1 The UV absorbance spectra of ENR-HRP

酶标抗原紫外扫描结果见图1。ENR的特征峰为275.5、317、334nm，HRP的特征峰为278、402nm，偶联产物经透析后其特征峰为278、314、329、402nm。可见，偶联产物的峰相比反应物的特征峰，既保留了反应物的特征峰也产生了新的特征峰，说明有新的物质产生，即表明酶标抗原合成成功。

表1 E-4抗体和酶标抗原最佳工作浓度的确定Table.1 The optimum concentration of 4 antibody and enzyme labeled antigens

表2 板内与板间变异实验Table.2 Plate variation with inter-assay and intra-assay

选择效价最高的E-4抗血清作为测试抗体，采用方阵法实验，具体结果见表2，当E-4抗体按1∶128000稀释包被、ENR-HRP按1∶256000稀释添加时，B/B0值达到最小为43.5%，即抑制率最高。考虑到发光值大小的因素，选定B/B0值为47.9%时包被抗体和酶标抗原稀释倍数为最佳工作浓度，即包被抗体按1∶64000倍稀释包被，酶标抗原按1∶256000倍稀释添加。

2.2 CLIA标准曲线线性范围及检测灵敏度

用添加的标准品浓度的对数和相应结合率分别作为横纵坐标，建立化学发光免疫检测方法标准曲线（图2）。当ENR在3～810pg/mL范围时，线性回归方程为y=-13.898x+110.38（R2=0.9893）。经计算，半抑制浓度IC50=69.63pg/mL，仅为蒋兴东[18]和刘红[19]建立的恩诺沙星直接竞争ELISA技术所得IC50的1/500，也仅为赵银丽[20]利用单克隆抗体技术对恩诺沙星进行研究所得IC50的1/15；方法的检测灵敏度IC10= 1.41pg/mL。

2.3 CLIA变异系数分析

图2 ENR化学发光免疫检测标准曲线Fig.2 The standard curve of ENR chemiluminescence immunoassay

变异系数表示一个生产周期生产的试剂盒和不同生产周期生产的试剂盒之间的差异度。表2实验结果显示一个生产周期的变异系数值为2.61%，不同生产周期变异系数值为4.71%，说明该种试剂盒在对恩诺沙星进行检测的过程中偏差不大，符合要求。

2.4 CLIA最低检测限与定量限分析

随机抽取本研究研制的ELISA试剂盒检测HPLC确证为阴性的10份鸡肉、10份鱼肉、10份虾肉、10份蜂蜜、10份牛奶，用于最低检测限和定量限分析。结果表明（表3），鸡肉、鱼肉、虾肉、蜂蜜、牛奶样品中ENR残留的最低检测限分别为3.76、4.59、2.85、2.65、4.20pg/mL或pg/g，最低定量限分别为6.13、7.35、3.57、3.73、6.48pg/mL或pg/g。

表3 鸡肉、鱼肉、虾肉、蜂蜜与牛奶空白组织样品的最低检测限与定量限（pg/g，pg/mL）Table.3 The LOD and LOQ in Blank tissue samples（chicken，fish，shrimp，honey，milk，pg/g，pg/mL）

2.5 CLIA样品基质的影响

添加恩诺沙星在3～810pg/mL浓度内，稀释检测物基质溶液16～32倍时，与空白组的检测结果相比几乎没有差别（图3），为简化操作步骤，缩短检测时间，在进行实际样品检测时，对基质分别进行16～32倍的稀释。

2.6 CLIA样品添加回收实验

将不同浓度的标准溶液混合到待测样品中，提取回收后计算添加值。添加恩诺沙星到鸡肉、鱼、虾、牛奶、蜂蜜等阴性待检样品中，添加浓度为50.0、100、1000pg/g（pg/mL），进行5次平行实验，得到测得值以及添加回收率，如表4所示。结果表明，添加50.0～1000pg/g（pg/mL）ENR的平均回收率在88.28%～102.6%内，本研究建立的CLIA方法的准确度符合要求，可用于鸡肉、鱼、虾、牛奶、蜂蜜等样品中ENR残留的快速检测。

表4 鸡肉、鱼、虾、牛奶、蜂蜜等样品添加回收实验Table.4 Test of recovery in chicken，shrimp，milk，honey

3 结论与讨论

化学发光免疫技术将高特异性的免疫反应与高灵敏度的化学发光技术相结合，相比于酶联免疫检测技术缩短了检测时间，大大降低了检测限。刘邓等[21]报道了一种基于鲁米诺-辣根过氧化物酶体系的化学发光免疫分析试剂盒，用于检测食品中的痕量恩诺沙星残留，得到的IC50为0.106ng/mL，检测时间约为50min。本研究的IC50明显要低于以上结果，即灵敏度更高；检测时间可以控制在30min以内，也优于以上方法。在对鸡肉、鱼肉、虾肉、蜂蜜和牛奶等空白组织样品中进行恩诺沙星实际样品检测实验中，最低检测限分别为3.76、4.59、2.85、2.65、4.20pg/mL。恩诺沙星添加回收实验结果表明，平均回收率在88.28% ～102.6%之间，板内和板间变异系数均低于10%。说明此方法符合现场快速检测食品中恩诺沙星残留的要求，值得在实践中进行推广。

在进一步的试剂盒开发研究中，将在精密性、特异性、保存期和相关性实验方面进行系统评价，为该方法的试剂盒商品化应用奠定基础。

图3 样品基质对试剂盒检测的影响Fig.3 The effect of specimen matrix on ELISA kit

[1]Prabhu R M，Piper K E，Litzow M R，et al.Emergence of quinolone resistance among viridans group streptococci isolated from the oropharynx of neutropenic peripheral blood stem cell transplant patients receiving quinolone antimicrobial prophylaxis [J].European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases，2005，24（12）：832-838.

[2]Förster C，Kociok K，Shakibaei M，et al.Quinolone-induced cartilage lesions are not reversible in rats[J].Archives of Toxicology，1996，70（8）：474-481.

[3]Urios A，Aleixandre V，Blanco M.Influence of recA mutations on gyrA dependent quinolone resistance[J].Biochimie，1991，73（4）：519-521.

[4]Wang Y P，Li L，Shen F J，et al.Quinolone-resistance in Salmonella is associated with decreased mRNA expression of virulence genes invA and avrA，growth and intracellular invasion and survival[J].Veterinary Microbiology，2009，133（2）：328-334.

[5]Yamamoto T，Takubo S，Fujita K，et al.Cloning and restriction analysis of DNA conferring new quinolone antimicrobial agent resistance from Staphylococcus aureus and other coagulasenegative Staphylococcus species[J].FEMS Microbiology Letters，1990，68（3）：325-339.

[6]Sonstein S A，Burnham J C.Effect of low concentrations of quinolone antibiotics on bacterial virulence mechanisms[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，1993，16（4）：277-289.

[7]Robert J D，Darius D，Hollings M T，et al.Identification and initial structure-activity relationships of a novel non-peptide quinolone GnRH receptor antagonist[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，1999，9（17）：2615-2620.

[8]Dimitrova D J，Lashev L D，Yanev S G，et al.Pharmacokinetics of enrofloxacin and its metabolite ciprofloxacin in male and female turkeys following intravenous and oral administration[J]. Veterinary Research Communications，2006，30（4）：415-422.

[9]Jerome J S，Pharm D，Thomas F G，et al.Quinolone pharmacokinetics in the elderly[J].The American Journal of Medicine，1992，92（4）：33-37.

[10]Wright D H，Herman V K，Konstantinides F N，et al. Determination of quinolone antibiotics in growth media by reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography B：Biomedical Sciences and Applications，1998，709（1）：97-104.

[11]肖勤.化学发光免疫分析新进展[J].分析实验室，2011，30（1）：112-122.

[12]张静.恩诺沙星化学发光酶免疫分析方法研究[D].郑州：郑州大学，2010.

[13]高泽斌，马悦，李晓兰.化学发光法和免疫印迹法检测糖尿病自身抗体的结果分析[J].放射免疫学杂志，2011，24（4）：453-454.

[14]谢玮，赵枰，陶国华.化学发光免疫分析测定胰岛素及C肽在2型糖尿病诊断中的临床应用[J].标记免疫分析与临床，2009，16（5）：283-285.

[15]邹晓楠，龚云飞，奚茜，等.恩诺沙星人工抗原及多克隆抗体的制备[J].安徽农业科学，2012，40（27）：13415-13417.

[16]蒋兴东，陈玉飞，涂健，等.恩诺沙星在肌肉组织中残留的ELISA检测方法研究[J].畜牧与兽医，2008，40（8）：30-33.

[17]刘红，曾振灵，杨桂香，等.恩诺沙星ELISA快速检测方法的建立[J].中国兽医杂志，2006，11（3）：13-15.

[18]赵银丽，王建华，王自良，等.抗恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及竞争ELISA试剂盒的研制[J].核农学报，2008，22（6）：898-903.

[19]刘邓，丁飞，侯瑞霞，等.恩诺沙星化学发光免疫分析试剂盒的研制[J].食品工业科技，2012，33（17）：325-329.

Study on detecting enrofloxacin residues in food by chemiluminescence immunoassay

GONG Yun-fei1，ZOU Xiao-nan1，ZHANG Lu-lu1，WU Ying-ying1，DAI Ming-yan1，CHEN Zong-lun2，ZHANG Ming-zhou1，*
（1.College of Life Science，China Jiliang University，Zhejiang Provincial Key Laboratory of Bio-metrology，Inspection and Quarantine，Hangzhou 310018，China；2.Hangzhou DNA Sci-tech Co.，Ltd.，Hangzhou 310013，China）

It was developed a chemiluminescence immunoassay（CLIA）method based on polyclonal antibody to detect the enrofloxacin residue in animal food.The CLEIA conditions were optimized.The optimal concentration of coating antibody dilution was 1∶64000 and the enrofloxacin markered enzymes dilution was 1∶256000.The results showed that：with an concentration range from 3 to 810pg/mL，the regression equation was y＝-13.898x+ 110.38（R2＝0.9893）.The 50%inhibition percentage（IC50）and sensitivity（IC10）was 69.63pg/mL and 1.41pg/mL，respectively.Actual sample testing experiment results showed：in chicken，fish，shrimp，honey and milk samples，the detection limits was 3.76，4.59，2.85，2.65 and 4.20pg/mL，respectively.The limit of quantity was 6.13，7.35，3.57，3.73 and 6.48pg/mL，respectively.Recoveries were between 88.28%～102.6%when ENR was spiked to samples at 50～1000pg/g（pg/mL）.The mean intra-assay variability and inter-assay was 2.61%and 4.71%，respectively.The CLIA which we stablished could be used to detect enrofloxacin residues in animal food.

enrofloxacin；chemiluminescence immunoassay；food safety

TS207.3

A

1002-0306（2014）04-0066-05

2013－08－02 *通讯联系人

龚云飞（1984-），硕士研究生，主要从事食品安全快速检测技术方面的研究。

浙江省重点科技创新团队（2010R50028）；浙江省科技成果转化项目（2011E61018）；浙江省国境安全检验检疫科技创新服务平台（2006C17014）；浙江省重大科技专项重点项目（2012C12013-3）。