在线SPE液质联用法分析原料糖浆中2-氨基乙酰苯

陈 盛，金 燕，刘绿叶，*

（1．浙江省台州市质量技术监督检测研究院，浙江台州318000；2．赛默飞世尔科技中国有限公司，上海201203）

在线SPE液质联用法分析原料糖浆中2-氨基乙酰苯

陈 盛1，金 燕2，刘绿叶2，*

（1．浙江省台州市质量技术监督检测研究院，浙江台州318000；2．赛默飞世尔科技中国有限公司，上海201203）

建立了一种采用在线SPE对糖浆中的2-氨基乙酰苯进行了富集、浓缩与去除有机杂质干扰样品前处理方式，同时采用高效液相色谱与质谱联用仪（HPLC-MS/MS）对样品中2-氨基乙酰苯（2-AP）进行了准确定性与定量分析的方法。在线SPE柱：采用100%亲水的Acclaim PA柱（4.0mm×30mm，5.0μm），分析柱采用ODS柱（2.1mm×150mm，3.0μm）；质谱方法，采用ESI源选择反应离子监测（SRM）模式，自动优化了S-Lens、CE等参数。结果表明：该方法的线性回归方程Y=-12123.6+33480.1X，相关系数r为0.9999，线性范围为0.3～150ng/mL，进样体积10.0μL，检出限（以S/N=3计）为0.03ng/mL，样品加标回收率达93%以上。采用该方法对3份不同的生产工艺糖浆样品进行了分析，结果表明均小于仪器检出限。

2-氨基乙酰苯，在线SPE，液质联用，糖浆

2-氨基乙酰苯（2-aminoacetophenone，简写为2-AP），是许多食品（如葡萄酒、果葡糖浆）中经常出现的一种重要的、具有芳香活性的微量物质，化学结构式如图1所示。1993年，人们发现含有2-AP的白葡萄酒中经常会出现一种类似于卫生球、地板漆、湿羊毛或者是杂醇酒精的口味，当酒中的2-AP浓度超过了某个感官阈值时，就会造成所谓“非典型老化（untypical aging）”的不良风味，简称为“UTA”现象，这种UTA现象的存在会严重影响葡萄酒的口感和风味。后来也有文献记录2-AP有可能存在于果葡糖浆中，导致了果葡糖浆产生UTA现象，影响产品正常的风味和口感[1-3]。因此，对于广大的果葡糖浆生产企业而言，2-AP的含量是一项必须的检测项目，以便能更好地预防控制和减少2-AP产生，以提高产品质量，满足市场需求。

2-氨基乙酰苯的检测方法有多种，由于其含有苯环（见图1），有较强的紫外吸收，且极性较弱，比较适合于反相液相色谱分离。ISBT方法[4]规定使用液相色谱紫外检测器对该化合物进行了分析，进样体积300μL，检测波长220nm，但该方法由于采用进样体积较大，且在低波长测定，使得基质干扰较为严重，不能进行准确的定性与低含量的定量分析。Fan等[5]建立了浸入式固相微萃取法（DISPME）和GC-MS联用法对2-AP进行了快速检测，采用内标法定量。整个分析时间需要约为40min，检测限为0.5～1.0μg/L，该方法分析时间较长，且前处理耗材使用的成本较高。因此，本文采用了在线SPE液质联用法对2-AP进行了分析。采用在线SPE方法对样品进行了富集与基质去除，前处理更为快速；同时，采用了液相色谱与三重四极杆质谱联用的方法，在反相条件下对2-AP与糖浆中的杂质进行了分离，选择反应离子监测模式进行了准确的定性与低含量的定量检测。该方法具有快速，易操作，方便，重复性好，检测限低等的特点，适合用于糖浆中2-AP的分析，对相关企业质量控制标准及科研分析工作者具有一定的参考和借鉴意义。

图1 2-氨基乙酰苯分子结构式Fig.1 Molecular structure of 2-aminoacetophenone

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

糖浆 来自某糖浆生产企业（批号分别为：20130201、20130301、20130401）；乙腈、甲醇、甲酸HPLC级，Thermo Fisher Scientific公司；2-氨基乙酰苯（CAS号：5468-37-1） 标准品（纯度99.8%），Sigma-Aldrich公司；超纯水 美国Millipore公司；其他未注明试剂 均为分析纯。

UltiMate 3000超高效液相色谱仪 Thermo Fisher Scientific公司，美国，主要配制：泵（内置脱气机，集成了左、右两个泵），型号：DGP-3600RS；自动进样器，型号：WPS-3000TSL（带自动清洗针功能）；TCC-3000RS柱温箱 装有一个六通阀；TSQ Vantage三重四极杆质谱仪 Thermo Fisher Scientific公司，美国；色谱工作站 Chromeleon 6.8 SR10；质谱工作站Xcalibur 2.2；根据以上仪器模块，配制成在线SPE液质联用模式，示意图见图2。

1.2 样品与标准品处理

图2 在线SPE液质联用示意图Fig.2 The figure of online SPE HPLC-MS/MS

样品前处理：精确称取样品3.0g，放入10mL进样瓶中，用含2%H3PO4的超纯水定量到10mL，在100℃下加热5min后，待冷却至室温，经0.45μm的滤膜过滤，装瓶并待测。

标准溶液的配制：精确称取2-AP标准物质的质量0.300g于100mL容量瓶中，加入25mL HPLC级乙腈，用超纯水定容至刻度，摇匀后制成0.300mg/L的标准储备液。然后用超纯水逐级稀释分别得到0.3、3.0、15.0、30.0、150.0ng/mL标准品，分别经0.45μm的滤膜过滤后装瓶，待测。

1.3 实验条件与方法

色谱条件：分析柱：Acclaim 120 C18（2.1mm× 150mm，3.0μm）；在线SPE柱：Acclaim PA C16（4.0mm× 30mm，5.0μm）。流动相为乙腈与0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱，其中，右泵提供分析柱洗脱流动相，左泵提供SPE分析洗脱流动相，见表1。进样体积：10.0μL。

质谱条件：ESI源，正离子模式，雾化温度：450℃，干燥气：2.06×105Pa，辅助气：3.44×105Pa，雾化电压：3.0KV。定性定量扫描模式：选择反应离子监测（SRM），碎片离子1：m/z 136.0～91.1，CE 24V；S-lens：56.0；碎片离子2：m/z 136.0～118.1，CE 14V；S-lens：56.0；碎片离子3：m/z 136.0-65.1 CE 36V；S-lens：56.0，其中碎片离子1为定量离子。

在线SPE六通阀切换时间：0min，阀位置1-2，SPE柱上样；2.2min，阀位置6-1，SPE柱洗脱；3.5min，阀位置1-2，SPE柱平衡/再生，分析柱开始分析。

表1 流动相梯度洗脱条件Table.1 The gradient elution condition of mobile phase

2 结果与讨论

2.1 在线SPE选择及质谱条件优化

在线SPE条件选择：本方法参考了相关在线SPE文献方法[6-7]，采用了更为亲水的C16小柱做为SPE柱，在0～2.2min内，糖浆样品中的亲水性基质化合物，被洗脱入废液，而在2.2～3.5min，2-AP被洗脱下来，经过六通阀切入分析柱ODS柱中，3.5min后，SPE小柱进入再生模式，而分析柱开始进入梯度洗脱分析。因此，该步骤去除掉了样品中的基质以及前处理样品使用到的磷酸溶液等。

质谱条件优化：通过Xcalibur质谱工作站，分别自动优化了S-lens，碰撞能量（CE），以及离子源雾化参数，最终选择了三对碎片离子进行监测分析。

表2 样品加标回收率结果Table.2 The results of recovery of spiked samples

2.2 标准溶液谱图及线性关系

参考“1.3”项中的条件与方法，分别对0.3、3.0、15.0、30.0、150.0ng/mL标准溶液进样10.0μL，谱图见图3（以0.5ng/mL为例），以质谱信号强度（Intensity）与峰宽（min）的乘积即峰面积为纵坐标Y，2-氨基乙酰苯浓度（ng/mL）为横坐标X，进行线性拟合，得线性回归方程为：回归方程为Y=-12123.6+33480.1X，相关系数r为0.9999，如图4所示。

图3 2-氨基乙酰苯标准品色谱图Fig.3 Chromatogram of 2-AP standard solution

图4 2-氨基乙酰苯标准曲线图Fig.4 Standard curve of 2-AP

2.3 精密度实验

对15.0ng/mL标准溶液进行了分析，连续进样了6针（进样体积10.0μL），保留时间（RT）为7.76min；峰面积平均值为538625，相对标准偏差（RSD）值为4.5%，重现性较好。

2.4 样品加标回收率实验

取空白样品3份，加入标准溶液适量，按照“1.3”项下色谱质谱条件进行测定（每份测定3次），根据外标法计算结果，然后计算回收率，结果见表2，回收率在93.3%～102.0%之间，回收率较好。

2.5 仪器检出限

分析了标准溶液最低浓度点0.03ng/mL，进样体积为10μL，其信噪比达到3.0以上。因此，得出对2-氨基乙酰苯的仪器最低检出限（LOD，以S/N=3计），达到0.03ng/mL。

2.6 实际样品含量测定

对某生产企业提供的三份糖浆样品分别进行了两次平行测定，结果均小于仪器的检出限。

3 结论

通过对TSQ vantage质谱参数的优化，同时采用online SPE在线富集浓缩的技术，具有三个优点：a.可以去除干扰，如原料糖中的糖浆，还有提取用的磷酸；b.可以降低检出限，最终达到0.03ng/mL；c.采用在线SPE技术比离线处理更快，重现性更好。因此，该方法适合用于糖浆或酿酒行业对2-氨基乙酰苯的分析要求，具有一定的推广与借鉴意义。

[1]许世枫，黄立新，徐正康.果葡糖浆中的2-氨基乙酰苯及其检测方法综述[J].食品与发酵工业，2008，34（3）：110-113.

[2]Katrin Hoenicke，Thomas J Simat，Hans Steinhart.Untypical aging off-flavor in wine：formation of 2-aminoacetophenone and evaluation of its influencing factors[J].Analytica Chimica Acta，2002，458：29-37.

[3]Ron G Buttery，Louisa C Ling.Importanceof2-aminoacetophenone to the flavor of masa corn flour products[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，4（1）：1-4.

[4]ISBT 14.0-2003.2-Aminoacetophenone（2-AP）[S].

[5]Wen1ai Fan，I-Min Tsai，Michae1 C Qian．Analysis of 2-aminoacetophenone by direct-immersion solid phase micro extraction and gas chromatography-mass spectrometry and its sensory impact in Chardonnay and Pinot gris wines[J]．Food Chemistry，2007，19（2）：1-23.

[6]郭娟，赵研，张晶.饮用水中的9种农药残留及微囊藻毒素的在线固相萃取-液相色谱-质谱法测定[J].卫生研究，2012，41（2）：235-238.

[7]Xiaona Li，Ning Yu，Jianmei Zhang.Quantitative determination of cyclophosphamide in rat plasma using an online SPE HPLCDAD[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2012，12：156-161.

Determination of 2-aminoacetophenone in syrup by online SPE HPLC-MS/MS

CHEN Sheng1，JIN Yan2，LIU Lv-ye2，*
（1.Taizhou Institution of Quality and Technical Supervision and Inspection，Taizhou 318000，China；2.Thermofisher Scientific Co.，Ltd.，Shanghai 201203，China）

An analytical method for determination of 2-aminoacetophenone in different Syrup by online SPE and HPLC MS/MS was developed which online SPE could enrich the target and remove the interference and HPLC-MS/MS could determine and quantitate of 2-aminoacetophenone.The SPE column was Acclaim PA（4.0mm×30mm），and the analytic column was ODS（2.1mm×150mm，3.0μm），and the Mass Spectrometry’s parameters（S-lens，CE，etc.）were automatic optimization with SRM mode.The results showed that the calibration formula was Y=-12123.6+33480.1X，the correction coefficient was above 0.9999，and the calibration curve was linear in the range of 0.3～150ng/mL，injection volume was 10.0μL and the detection limit of the method（with S/N=3）was 0.03ng/mL，the recoveries of spiked samples were more than 93%.Then 3 different samples were analyzed with this method，the contents were not detected.

2-ainoacetophenone；online SPE；HPLC MS/MS；syrup

TS247

A

1002-0306（2014）04-0076-03

2013－07－30 *通讯联系人

陈盛（1983-），男，硕士研究生，研究方向：食品的检测技术研发和质量管理。