刺梨果渣发酵饲料蛋白的工艺研究

张瑜，李小鑫，罗昱，刘芳舒，丁筑红

（贵州大学食品与酿酒工程学院，贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州省药食同源植物资源研究开发中心，贵州贵阳550025）

刺梨果渣发酵饲料蛋白的工艺研究

张瑜，李小鑫，罗昱，刘芳舒，丁筑红*

（贵州大学食品与酿酒工程学院，贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州省药食同源植物资源研究开发中心，贵州贵阳550025）

以刺梨果渣为原料发酵生产饲料蛋白。研究以发酵产物中蛋白含量为指标，通过混合菌种进行发酵，筛选出最佳菌种比例，并通过单因素试验和正交试验得到混合菌发酵的最佳工艺条件。结果显示，最佳菌种组合为白地霉/康宁木霉/热带假丝酵母（2∶1∶2），产物中蛋白质含量为14.87%；混合菌发酵的最佳工艺条件为尿素添加量2%，装料量50 g/250 mL，料液比1∶1（g∶mL），接种量17%，发酵温度30℃，发酵时间5 d。发酵产物中蛋白质含量较未发酵果渣提高了175.8%，游离氨基酸含量提高了56.3%，可溶性膳食纤维提高了37.34%，适口性得到改善，同时具有刺梨的特殊香味，适合作为饲料添加剂。

刺梨果渣；饲料蛋白；发酵工艺

贵州省刺梨资源十分丰富，鲜果蕴藏量约20～30万t，在加工利用方面，大多数厂家以刺梨原汁为主，果实榨汁后产生的近50%的皮渣，直接作为饲料食用效果不佳，目前一般都是作为废弃物处理或者简单加工用于肥料部分添加，造成资源的极大浪费，而且果渣极易霉变发臭，对环境造成严重污染。

利用果蔬加工中废弃的皮渣发酵生产饲料蛋白，国内外已经有很多研究和应用。殷月兰等[1]利用绿色木霉（Trichoderma viride）、白地霉（Geotrichum candidum）、产朊假丝酵母（Candida utilis）和米曲霉（Aspergillus oryzae）进行混菌发酵三七渣，纤维素明显降低，蛋白质含量提高，各类氨基酸的含量均衡，提高了三七渣的饲用价值。尹涛[2]利用苹果渣为原料，采用固态好氧发酵，引入白腐真菌（Pleurotus ostreatus）和绿色木霉作为高效微生物菌群，并通过对发酵条件的控制，转化为环境友好的有机肥料，使有机肥料肥分达到最高水平，对果渣进行了有效的利用。国外有利用芽孢杆菌（Bacillus subtilis）MA139固态发酵法制备饲料蛋白[3]，ILLANES A等[4]利用纤维素酶和突变株木霉对甜菜粕进行发酵制得饲料蛋白。而刺梨果渣发酵菌体蛋白饲料[5-8]这一方面研究很少。

通过参考其他果渣废弃物研究的实践基础上，研究刺梨果渣的开发利用。刺梨果渣含有较多的糖、氨基酸、维生素C和黄酮类物质[9]，营养丰富，可以作为原料进行多种加工利用，开发出多种刺梨产品，不仅可以变废为宝，还能保护环境，实现果渣资源的综合利用，避免刺梨资源的浪费。开发研究饲料蛋白、膳食纤维和其他发酵产品，提高产品的附加值，减少浪费，为刺梨果渣的产业化开发提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺梨果渣：刺梨由贵州省龙里县提供，属于贵农5号品种，将刺梨榨汁后留取果渣，用保鲜袋密封装好，于4℃的冰箱中保存备用。

菌种：康宁木霉（Trichodermakoningii）GIM3.444、白地霉（Geotrichumcandidum）GIM2.69、热带假丝酵母（Candida tropicalis）GIM2.6：广东省微生物菌种保藏中心。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，自来水1000mL，pH自然，121℃、0.1 MPa灭菌30 min。

麦芽汁琼脂培养基：麦芽汁150 mL，琼脂3 g，pH自然，121℃、0.1 MPa灭菌30 min。

耐高温α-淀粉酶（2×104U/g）、中性蛋白酶（5×104U/g）、糖化酶（1×105U/g）：美国Sigma公司；无水乙醇（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；浓硫酸（分析纯）、盐酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：重庆川东化工有限公司；硫酸铜（分析纯）：宜兴市辉煌试剂有限公司；硼酸（分析纯）：西陇化工有限公司。

1.2 仪器与设备

101-3A电热鼓风干燥箱、SPX-150B型生化培养箱：天津泰斯特仪器有限公司；KDN-04A凯氏定氮仪：浙江托普仪器有限公司；YXQ-LS-30SⅡ高压蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司；T6新世纪紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；L-8800氨基酸自动分析仪：北京温分分析仪器技术开发有限公司；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵：郑州市世纪双科实验仪器有限公司；SX-2.5-10马弗炉：南阳市鑫宇炉业有限公司；TGL-16G高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 刺梨果渣发酵饲料工艺路线

1.3.2 操作要点

采用新鲜的刺梨果渣，向刺梨果渣中加入一定量的尿素，与刺梨果渣混合均匀，制成固态培养基。白地霉/康宁木霉/热带假丝酵母混菌按照适当的比例接入固态培养基，在自然pH条件下，28℃培养箱中固态发酵培养4d。将发酵物在50℃条件下烘干至质量恒定，干燥物粉碎至60目备用。

1.3.3 种子液的制备[10]

一级种子试管培养：从斜面培养基上挑取一环，接种到在5 mL的液体培养基中，摇匀后，置于30℃培养箱中，培养24 h。

二级种子摇瓶培养：以5%的接种量将一级种子液接种到装有60 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，置于30℃培养箱中，180 r/min，培养8 h。

种子液体扩大培养：以20%的接种量将二级种子液接种到装有300mL液体培养基的1000mL三角瓶中，置于30℃培养箱中，180 r/min，培养8 h。

霉菌种子扩大培养[11]：从种子培养基上挑取一环，接种到斜面培养基上，28℃，培养72 h。用10 mL无菌水冲洗孢子，取1 mL接种到装有60 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，在28℃，200 r/min，培养36 h。

1.3.4 发酵菌种的筛选

选择合适的菌种及比例，在250 mL三角瓶中装入50 g的果渣培养基，按照发酵工艺流程分别接入10%的种子液。在自然pH条件下，28℃培养箱中固态发酵培养4 d，将发酵后的产物在50℃条件下烘干至质量恒定，然后分析测定其蛋白含量。

1.3.5 发酵条件的研究

采用不同无机氮源、料液比、装料量、接种量、发酵温度及时间进行单因素试验，在自然pH条件下，28℃培养箱中固态发酵培养4 d，在50℃条件下将发酵后的果渣烘干至质量恒定，测定其蛋白含量。在单因素试验基础上，选择4因素3水平正交试验设计优化发酵条件，正交试验因素与水平见表1。

表1 发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.6 分析测定方法

灰分含量的测定：参照国标GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》中方法[12]；蛋白质含量的测定：分光光度法[13]；膳食纤维的测定：酶-重量法[14]；维生素C的测定：钼蓝比色法[15]；还原糖的测定：3，5-二硝基水杨酸法（dinitrosalicylic acid，DNS）[16]；游离氨基酸测定：氨基酸测定仪[17]；黄酮的测定：分光光度计法[18]。

2 结果与分析

2.1 混菌比例对发酵产物的影响

混菌发酵时，菌种之间可互相补偿进行协同发酵，与单菌发酵相比能明显提高蛋白质的含量[10]。在250 mL三角瓶中装入50 g的果渣培养基，按照发酵工艺流程分别接入10%的混合种子液，分别采用不同比例白地霉/康宁木霉/热带假丝酵母混菌发酵，考察混菌比例对发酵产物中蛋白质含量的影响，结果见图1。

图1 不同混菌比例对蛋白质含量的影响Fig.1 Effect of different strains ratio on crude protein yield

由图1可知，白地霉、康宁木霉和热带假丝酵母之间不同比例对发酵结果影响差别较大，当三者之间的比例为2∶1∶2时，产物中蛋白含量达到最高为14.87%，显著性增加（P＜0.05）。白地霉和康宁木霉的接种比例太少会影响纤维素酶、淀粉酶等的分泌，导致果渣纤维素的降解效果差。但若霉菌接入比例过多，菌种之间的竞争作用大于协同作用也会影响发酵。因此，选择白地霉/康宁木霉/热带假丝酵母的比例为2∶1∶2作为混合菌最佳配比。

2.2 发酵条件筛选结果

2.2.1 无机氮源对发酵产物中蛋白质含量的影响

向刺梨果渣培养基中分别添加的1%、2%、3%、4%、5%尿素，接入10%的混合菌种液体种子。在自然pH条件下，28℃培养箱中固态发酵培养4d，在50℃条件下将发酵后的果渣烘干至质量恒定，然后测定其蛋白质含量，结果见图2。

图2 尿素添加量对蛋白质含量的影响Fig.2 Effect of different nitrogen addition on crude protein yield

微生物的生长需要利用无机氮源合成蛋白质，而刺梨果渣中含氮量少，无法满足微生物的生长，需要加入无机氮源调节碳/氮（C/N）比例，更有利于提高蛋白质的含量。尿素廉价易得，成本低，故以尿素为氮源[20]。由图2可知，果渣发酵后产物中蛋白质含量有明显的提高，随着尿素添加量的增加，发酵产物中蛋白质含量呈增长趋势，尿素添加量＞2%后，蛋白质产量增加不明显，超过3%时蛋白质含量下降。此外，尿素的分解需要尿素酶，残留过多会影响品质，需要控制添加量[21]。综合考虑，选择2%为尿素的最佳添加量。

2.2.2 料液比对发酵产物中蛋白质含量的影响

每个250 mL三角瓶中添加50 g新鲜果渣，添加2%尿素，设置料液比分别为1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4（g∶mL），接入10%的混合菌种液体种子。在自然pH条件下，28℃培养箱中固态发酵培养4 d，在50℃条件下将发酵后的果渣烘干至质量恒定，然后测定其蛋白质含量，结果见图3。

图3 料液比对蛋白质含量的影响Fig.3 Effect of different material-water ratio on crude protein yield

在固体发酵过程中，培养基中水分含量对微生物的生长繁殖有很大的影响，因此微生物在发酵过程中须有其适宜的水分，才能保证发酵效果。霉菌和酵母需要的水分环境一般在65%左右[22]。由图3可知，料液比为1∶1（g∶mL）时，蛋白质含量最高。含水量过高导致发酵基质多孔性降低，空气减少，易引起发酵温度过高，从而抑制了菌体的生长繁殖，反之含水量过低，培养基水分不充足，微生物生长受到抑制。由于果渣本身含有较多的水分，不需要加太多水，选择料液比1∶1（g∶mL）为最佳。

2.2.3 装料量对发酵产物中蛋白质含量的影响

设置装料量分别为20 g/250 mL、30 g/250 mL、40 g/250 mL、50 g/250 mL、60 g/250 mL、70 g/250 mL、，料液比1∶1（g∶mL），添加2%尿素，接入10%的混合菌种种子液。在自然pH条件下，28℃培养箱中固态发酵培养4 d，在50℃条件下将发酵后的果渣烘干至质量恒定，然后测定其蛋白质含量，结果见图4。

刺梨渣发酵中各菌种同时生长，属于好氧兼性厌氧生长。因此，空气的流通对微生物发酵有很大的影响，在提供微生物生长所需的氧气的同时，还能带走发酵产生的热量和二氧化碳，提高发酵效率。由图4可知，随着装料量的增加，蛋白质含量呈下降趋势。装料量在20～50 g/250 mL之间蛋白质含量变化不大，50 g/250 mL之后下降明显，这是因为随着装料量增加，由于果渣堆积过厚，影响了空气的流通，微生物的生长受到抑制。考虑到发酵效果和经济产能，选择50 g/250 mL的装料量较好。

图4 不同装料量对蛋白质含量的影响Fig.4 Effect of different liquid medium volume on crude protein yield

2.2.4 接种量对发酵产物中蛋白质含量的影响

每个250mL三角瓶中添加50g新鲜果渣，分别接入5%、10%、15%、20%、25%的混合菌种种子液，料液比1∶1（g∶mL），添加2%尿素。在自然pH条件下，28℃培养箱中固态发酵培养4 d，在50℃条件下将发酵后的果渣烘干至质量恒定，然后测定其蛋白质含量，结果见图5。

图5 不同接种量对蛋白质含量的影响Fig.5 Effect of different inoculum on crude protein yield

由图5可知，随着接种量的增加，菌种间的协同作用促进生长代谢，发酵产物中蛋白质含量也随之增加，接种量为15%时，蛋白质含量最高。接种量过大，菌体繁殖过快、温度升高，产生过多的代谢废物，影响后期发酵，蛋白质含量反而有所下降；适宜的接种量，能够有效地缩短发酵周期，提高发酵产物蛋白质含量。考虑经济的角度和生产实际需要，选择接种量为15%。

2.2.5 温度对发酵产物中蛋白质含量的影响

发酵温度分别设置为24℃、26℃、28℃、30℃、32℃，每个250mL三角瓶中添加50g新鲜果渣，料液比1∶1（g∶mL），添加2%尿素，接入15%的混合菌种种子液。在自然pH条件下，恒温培养箱中固态发酵培养4 d，在50℃条件下将发酵后的果渣烘干至质量恒定，然后测定其蛋白质含量，结果见图6。

图6 发酵温度对蛋白质含量的影响Fig.6 Effect of fermentation temperature on crude protein yield

温度是影响微生物生长的重要因素之一。温度的改变常常影响微生物体内生化反应的速度，以及影响微生物的繁殖速度。由图6可知，发酵温度在30℃时微生物生长繁殖旺盛，蛋白质含量达到最高；而温度过高，会使微生物体内蛋白质或核酸变性失活，菌体的生长受到抑制，产物中蛋白含量也随之下降。因此，30℃为发酵的最适温度。

2.2.6 发酵时间对蛋白质产物的影响

发酵时间水平分别设置为1d、2d、3d、4d、5d、6d，每个250mL三角瓶中添加50g新鲜果渣，按料液比1∶1（g∶mL），添加2%尿素，15%的混合菌种种子液。在自然pH条件下，28℃培养箱中固态发酵培养，在50℃条件下将发酵后的果渣烘干至质量恒定，然后测定其蛋白质含量，结果见图7。

图7 发酵时间对蛋白质含量的影响Fig.7 Effects of fermentation time on crude protein yield

由图7可知，发酵初期，在1～3 d内，由于营养丰富，微生物快速的生长繁殖，产物中的蛋白质含量逐渐增加；到了发酵中期，在3～5d内，随着培养基中糖类的消耗，同时木霉将果渣降解成糖类等物质，微生物生长进入一个相对平衡的阶段，产品的粗蛋白基本保持恒定；发酵后期，5～7 d内随着营养物质消耗殆尽，发酵副产物的增加，微生物无法继续生长，蛋白质含量开始出现降低趋势。发酵5d时，产物中蛋白质含量达到最大值，故选择发酵时间为5d为最佳。

2.3 发酵条件优化正交试验的结果

根据单因素的试验结果，固定白地霉/康宁木霉/热带假丝酵母为2∶1∶2、尿素添加量2%及发酵时间5 d，选择果渣的装料量、发酵温度、接种量和料液比进行L9（34）正交试验，结果与分析见表2，正交试验结果方差分析见表3。

表2 发酵条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表3 正交试验结果的方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，影响试验结果因素依次为A＞D＞C＞B，即装液量＞料液比＞接种量＞发酵温度，确定发酵条件最优水平组合为A3D2C3B2，即装料量55 g/250 mL，料液比1∶1（g∶mL），接种量17%，发酵温度30℃。在此最佳条件下进行验证试验，发酵产物中蛋白质含量为19.06%。

由表3可知，装液量对蛋白质含量结果影响显著（P＜0.05），料液比、接种量及发酵温度对结果影响不显著。2.4发酵后果渣成分分析

按照最优工艺条件及参数进行发酵培养，并对发酵后的产物进行测定，结果见表4。

由表4可知，发酵后产品中的蛋白质提高至19.06%，提高了171%，可溶性膳食纤维提高了37.34%，可溶性糖降低了93.77%，还原糖降低了66.5%，由于发酵过程中温度和空气的影响，维生素C损失较大，损失量84.13%。发酵后的果渣蛋白质明显提高，不溶性纤维降低，营养成分得到重组，更适合做饲料添加剂。

表4 发酵前后刺梨果渣营养成分含量的比较Table 4 Comparision of nutritional ingredients in

对刺梨果渣中的游离氨基酸进行测定，共检出15种氨基酸，其中精氨酸含量最高，为2.456 mg/g，其次为亮氨酸0.946 mg/g、赖氨酸0.961 mg/g。果渣发酵后，产物中游离氨基酸明显增高，必需氨基酸含量丰富，可以作为一种理想的饲料蛋白。

3 结论

本试验研究混合菌种对刺梨果渣的利用情况和固态发酵蛋白饲料的工艺条件，并对发酵前后营养成分的变化进行了研究。结果表明，以白地霉/康宁木霉/热带假丝酵母为2∶1∶2，接种量为17%，尿素添加量2%，装料量55g/250mL，料液比1∶1（g∶mL），发酵温度30℃，发酵时间5 d，得到的发酵产物中蛋白质含量为19.06%。

该试验中采取固态发酵，成本低、投入少、操作简单，可大量生产刺梨果渣，解决刺梨果渣腐烂造成的环境污染等问题，不仅丰富了刺梨果渣的利用途径，还能在一定程度促进畜牧业的发展，为解决我国蛋白质饲料的短缺开辟一条渠道。

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Fermentation technology of feed protein withRoxburgh rosepomace

ZHANG Yu,LI Xiaoxin,LUO Yu,Liu Fangshu,DING Zhuhong*
(Guizhou Research and Development Center of Medicinal and Edible Plant Resources,Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store and Processing of Guizhou Province,College of Food and Wine Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Roxburgh rosepomace was used for the production of feed protein by fermentation.Using protein content in fermentation product as index, by the means of mixed strains fermentation,the optimal mixed strain ratio was screened.Then single factor test and orthogonal test was employed to get optimum process conditions of mixed starin fermentation.It turned out that the optimal compound strains wereGeotrichum candidum∶Trichoderma koningii∶Candida tropicalis2∶1∶2.Under this condition,the protein content was 14.87%.The optimal solid-state fermentation conditions were as follows:urea 2%,loading volume 50 g/250 ml,material-water ratio 1∶1(g∶ml),temperature 30℃,inoculum 17%,fermentation time 5 d.Under this condition,the protein content,free amino acids content and soluble dietary fiber increased 175.8%,56.3%and 21.06%,respectively.The product had better palatability with specialR.roseflavor,which was suitable for using as feed additives.

Roxburgh rosepomace;feed protein;fermentation processing

TS209

A

0254-5071（2014）11-0075-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.017

2014-07-17

贵州省科技厅区域合作项目（黔科合区域合[2013]7001号）；贵州省重大科技专项（黔科合重大专项字[2013]6006）；黔科合G字[2014]4003

张瑜（1990-），女，硕士研究生，研究方向为食品科学。

*通讯作者：丁筑红（1966-），女，教授，本科，从事农产品加工教学科研工作。