丝状真菌发酵木糖产乙醇的研究

石琢，李清明，，熊兴耀，温潜，胡秋龙，苏小军，*

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128；2.湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南长沙410128；3.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081）

丝状真菌发酵木糖产乙醇的研究

石琢1，李清明1，2，熊兴耀2，3，温潜1，胡秋龙2，苏小军1，2*

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128；2.湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南长沙410128；3.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081）

以木质纤维素为原料生产燃料乙醇是目前的一个研究重点，其中利用木糖产乙醇微生物的研究尤为重要。本文简要概述了自然界中能利用木糖产乙醇的几种主要丝状真菌及基因工程技术在之研究中的应用，并展望了今后的研究方向。

丝状真菌；发酵；木糖；乙醇

伴随着经济的快速增长，石油、煤等不可再生能源遭到了过度的开发利用，这些化石能源正一步步走向枯竭，为此开发新的可再生能源迫在眉睫。生物质燃料乙醇是一种可再生的清洁能源，它不仅可以代替对水资源有污染的汽油增氧剂甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE），还能使燃烧更加充分并能使颗粒物、挥发性有机化合物、CO等大气污染物的排放量平均降低1/3以上[1-2]。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，分别约占35%～50%、20%～35%和10%～15%[3]。纤维素的降解产物以六碳糖为主，而半纤维素的降解产物则以五碳糖为主[4]。木糖是木质纤维素水解后的主要五碳糖，占总糖含量的10%～40%[3-4]。自然界中许多微生物能利用木糖产乙醇，如树干毕赤酵母、管囊酵母等，但普遍存在乙醇转化效率不高的问题[5]。因此，对于能利用木糖产乙醇的微生物的研究就显得十分重要。丝状真菌具有丰富的木质纤维素酶酶系，已被广泛应用于木质纤维素的酶解和纤维素酶的生产当中，是工业用纤维素酶的主要生产菌种之一[6]。目前关于丝状真菌在纤维乙醇上的应用研究主要集中在产酶和酶解机制等方面，而对于利用丝状真菌转化乙醇的研究较少[7-8]。一些丝状真菌如粗糙脉孢菌、尖孢镰刀菌等，不仅可以快速降解木质纤维素，而且还具备利用木糖、纤维二糖、寡糖等转化为乙醇的能力[8-9]。如何开发利用这些具备木糖乙醇转化能力的菌株，为木糖乙醇发酵提供新的菌种资源是目前纤维乙醇领域的一个重要方向。本文简要综述了几种主要丝状真菌利用木糖产乙醇的研究进展，并对以后的研究方向进行了展望。

1 丝状真菌

丝状真菌俗称霉菌，意指“会引起物品霉变真菌”，通常指那些菌丝体较发达又不产大型肉质子实体结构的真菌。丝状真菌形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明；菌落与培养基紧密相连，不易挑取；菌落颜色有紫色、白色和奶黄色等。丝状真菌营养体的基本单位是菌丝，根据菌丝是否有隔膜分为无隔菌丝和有隔菌丝两类。丝状真菌的繁殖能力很强，主要通过产生大量的无性孢子或有性孢子完成；在通气搅拌或振荡的霉菌液体培养基中，通常会产生菌丝球[10]。

2 丝状真菌在利用木糖产乙醇微生物中的地位

目前已经发现的能利用木糖的微生物超过100种，包括细菌、真菌和酵母菌[11]。丝状真菌在木糖发酵微生物的研究中占主要地位，是一类具有很大开发应用前景的微生物。从表1可以看出，与其他微生物相比，丝状真菌不仅能代谢葡萄糖、甘露糖和半乳糖等六碳糖，还能有效地利用木糖和阿拉伯糖等五碳糖，且在发酵过程中所形成的产物主要为乙醇，并对乙醇和酸都有很好的耐受能力，可在无氧的条件下发酵[12]。

表1 多种天然微生物生产乙醇的利弊比较Table 1 Pros and cons of various natural microorganisms for ethanol production

3 丝状真菌利用木糖的代谢途径

目前许多研究认为，丝状真菌按图1的代谢路径利用木糖生产乙醇[13-15]。丝状真菌首先在木糖还原酶（xylose reductase，XR）的作用下将木糖还原成木糖醇，然后在木糖醇脱氢酶（xylitol dehydrogenase，XDH）的作用下转化为木酮糖，且这两个环节均需要还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）作为辅酶。木酮糖激酶（xylulokinase，XK）将木酮糖磷酸化生成5-磷酸木酮糖，经过磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，PPP）后生成的6-磷酸葡萄糖和3-磷酸甘油醛进入糖酵解途径，生成糖代谢的中心产物丙酮酸，在缺氧条件下丙酮酸被丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶脱羧还原成乙醇。

图1 丝状真菌木糖代谢途径Fig.1 Xylose metabolic pathway of filamentous fungi

4 自然界中能发酵木糖产乙醇的丝状真菌

自然界中能发酵木糖产乙醇的丝状真菌种类较多，但相关研究较少，研究较多的有腐生真菌、木霉、粗糙脉孢菌和尖孢镰刀菌等[16-22]。

4.1 腐生真菌

腐生真菌是一类从已死动植物或其他有机质中吸取营养以维持自身正常生活的微生物，它们能有效地降解木质纤维素，是纤维素乙醇研究中的热门菌种。金花等[23]研究表明，腐生真菌（Mucor indicus）在以木糖、葡萄糖为共同碳源的发酵体系中乙醇转化率可达0.46 g/g（乙醇产量/耗糖量），不同碳源条件下乙醇转化率高低顺序为（木糖+葡萄糖）＞葡萄糖＞木糖。在湿氧化预处理的小麦秸秆水解液培养基中，腐生真菌（Mucor indicus）乙醇转化率最高为0.37g/g。Mucor indicus能较好地代谢混合糖（木糖+葡萄糖），且乙醇转化率接近理论值0.51 g/g。但Mucor indicus在以木糖为唯一碳源时，乙醇转化率不高，只有理论值的35%。

褐色腐生真菌（Neolentinus lepideus）不仅能利用葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、纤维二糖、麦芽糖和乳糖生产乙醇，而且还具有完整的木质纤维素降解酶系，能直接发酵麦麸等生物质原料。褐色腐生真菌（N.lepideus）在好氧、半好氧及缺氧条件下均能代谢木糖，在5%的木糖发酵培养基中，乙醇产量分别为0.30 g/g、0.33 g/g、0.34 g/g，且分别在发酵96 h、96 h、192 h将木糖消耗完毕[24]。

4.2 粗糙脉孢菌

粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）属于脉孢菌属，具有完整的木质纤维素降解酶系，能有效地利用木糖和葡萄糖发酵生产乙醇[8]。在小麦秸秆和麦麸的固体培养基中，粗糙脉孢菌能分泌内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶及β-木糖苷酶，产量分别可达492.8 U/g、1.08 U/g、26.7 U/g、297.8 U/g和0.132 U/g，高效分泌的木聚糖酶能将木聚糖降解为木糖和低聚木糖，能有效提高纤维乙醇产量[25]。张潇等[9]研究了通氧量、培养基初始pH值、初始木糖浓度等因素对粗糙脉孢菌发酵木糖的影响，得出了粗糙脉孢菌适合在半好氧条件下产乙醇的结论，乙醇转化率达到63.2%。ZHANG Z H等[20]的研究了传氧速率对粗糙脉孢菌AS3.1602木糖发酵、细胞内新陈代谢以及关键酶的影响，在传氧速率为8.4 mmol/（L·h）时，乙醇产量最高，为0.34 g/g。并认为在缺氧条件下粗糙脉孢菌几乎不代谢木糖。LI J G等[26]对粗糙脉孢菌木糖代谢途径的转录组进行研究，并运用分层聚类分析等方法将葡萄糖、阿拉伯糖代谢途径的转录组进行比对。研究表明，同为戊糖的阿拉伯糖的基因表达图谱与木糖的完全不同，并发现XAT-1（NCU01132）、XYT-1（NCU05627）基因与木糖和阿拉伯糖的代谢有关。

4.3 尖孢镰刀菌

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）能有效利用葡萄糖和木糖，且能同时糖化和发酵木质纤维素[21]。范金霞等[27]的研究表明，尖孢镰刀菌以纯葡萄糖为发酵底物的乙醇产量为8.50 g/L，高于以纯木糖为发酵底物的5.77 g/L，而在以葡萄糖/木糖为碳源的混合糖发酵中，葡萄糖和木糖比值为3∶1时乙醇产量最大，为7.53 g/L。已报道的产乙醇含量较高的尖孢镰刀菌是VTT-D-80134，在适当条件下乙醇产量可达0.5 g/g[28]。尖孢镰刀菌对发酵液中的抑制物有较好的耐受性，且对单一抑制物的耐受性强于混合抑制物。尖孢镰刀菌发酵产乙醇时对抑制物的耐受性为甲酸＜乙酸＜香草醛＜邻苯二酚＜糠醛[29]。范金霞等[30]还首次报道了尖孢镰刀菌的乙醛脱氢酶基因DNA序列，挖掘出了23条假定乙醛脱氢酶基因，并获得了aldn-19的核苷酸序列。

5 基因工程技术在丝状真菌研究中的应用

丝状真菌虽然能利用木糖产生乙醇，但转化效率并不理想，因此选育发酵性能优良的菌株就显得尤为重要，而基因工程技术的应用为获得高产菌株提供了可能。利用基因工程技术获得高效代谢木糖产乙醇菌株的研究思路主要有两条：一是向能高效利用六碳糖产乙醇的菌种中引入五碳糖代谢途径；二是向能利用混合糖但乙醇产量低的菌种中引入高效产乙醇的基因[31]。因酵母菌、大肠杆菌能高效利用葡萄糖，因此目前对酵母菌、大肠杆菌等菌种进行基因重组的研究较多，研究工作主要集中在引入五碳糖途径[32-33]。相比之下，对丝状真菌进行基因改良的研究不多，主要为从丝状真菌中挖掘五碳糖代谢关键基因，将其重组到能高效代谢葡萄糖的菌株中。

SALOHEIMO A[34]等成功地将丝状真菌里氏木霉（Trichderma reesei）的hxt1、hxt2、hxt4、hxt7和trxlt1五碳糖转运因子基因重组到酵母中，有效提高了木糖利用率。向尖孢镰刀菌中载入endo-β-1,4-xylanase 2基因，有效提高了细胞外液木聚糖酶的活跃度，得到的转化株发酵玉米芯产乙醇含量比野生菌株高出约60%，尖孢镰刀菌木聚糖酶同源超表达能增强尖孢镰刀菌在联合生物发酵（consolidated bioprocessing，CBP）模式下的发酵性能[35]。

6 展望

在纤维乙醇研究中，木糖的高效转化是重要内容之一。丝状真菌能广泛地利用包括木糖在内的多种糖类，具有很好的研究和开发前景。但野生丝状真菌还存在利用木糖速率较慢，产乙醇能力不强、产副产物较多等问题。因此，需要对现有菌株进行改良。采用比较基因组学的方法研究丝状真菌利用木糖产乙醇的代谢途径，明确关键基因，进而利用基因工程技术培育新的菌株，是新的研究领域。此外，进一步挖掘新的菌株资源也仍然是一项十分重要的工作。

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Ethanol production with xylose fermentation by filamentous fungi

SHI Zhuo1,LI Qingming1,2,XIONG Xingyao3,WEN Qian1,HU Qiulong2,SU Xiaojun1,2*
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation and Utilization,Changsha 410128,China; 3.The Institute of Vegetables and Flowers,Chinese Academy of Agriculture Sciences,Beijing 100081,China)

Fermentation of lignocelluloses for ethanol production has become a research focus,with special emphasis on the study of microorganism for fermenting xylose to ethanol.Several filamentous fungi which can use xylose for ethanol production and the application of genetic engineering technology in the study were introduced in this paper.In addition,the research prospect was discussed.

filamentous fungi;fermentation;xylose;ethanol

TQ223.122

A

0254-5071（2014）11-0047-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.010

2014-09-19

国家重点基础研究发展计划‘973计划’（2012CB723004）

石琢（1991-），女，硕士研究生，研究方向为生物质能源。

*通讯作者：苏小军（1975-），男，副研究员，博士，研究方向为生物质能源。