mTSLP-V1/V2融合蛋白的真核表达与鉴定①

楚 鹰 王亭亭 芮昱文 宋思维 苏艾荣 程 林 宋红勇 郑大同 吴稚伟

（南京大学医学院公共健康医学中心，南京 210093）

mTSLP-V1/V2融合蛋白的真核表达与鉴定①

楚 鹰 王亭亭 芮昱文 宋思维 苏艾荣 程 林 宋红勇 郑大同②吴稚伟③

（南京大学医学院公共健康医学中心，南京 210093）

目的:将鼠胸腺基质淋巴细胞生成素（mouse thymic stromal lymphopoietin，mTSLP）与人免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）B亚型分离株BAL的gp120 V1/V2结构域在293F真核细胞表达体系中进行融合表达。方法:以真核表达质粒pCEP-Pu为载体，构建mTSLP与gp120BALV1V2融合基因的重组蛋白表达质粒pCTV1V2BAL。限制性酶切电泳与测序验证质粒构建正确后，使用PEI瞬时转染293F悬浮细胞，表达产物以SDS-PAGE与Western blot进行分析，并对纯化后重组蛋白的V1/V2抗原表位进行了ELISA分析。结果:SDS-PAGE、Western blot分析显示，在表观分子量35 kD至55 kD的范围内存在一条不均一的糖蛋白条带，并且能与抗mTSLP多克隆抗体和抗His标签单克隆抗体发生反应。HIV-1阳性病人血清能够识别mTSLP-V1/V2BAL上的HIV-1V1/V2抗原表位。结论:在293F中成功表达了mTSLP-V1/V2BAL融合蛋白，该蛋白具有HIV-1gp120BALV1/V2区的抗原表位，能够用于HIV-1 gp120 V1/V2亚单位疫苗的研究。

人免疫缺陷病毒1型;gp120可变区1/2;鼠胸腺基质淋巴细胞生成素;293F表达体系;融合蛋白

自从1983年HIV被确认为AIDS的病因以来［1］，全世界科学家经过30年的努力，仍然没有找到能够阻断病毒传播的有效疫苗。HIV作为以性传播作为主要传播方式的病原体，有效的疫苗需要在病毒入侵的黏膜部位诱导强有力且持久的体液免疫反应。因此设计能够诱导黏膜抗体，特别是特异性的IgA与IgG的疫苗具有重要意义［2］。胸腺基质淋巴细胞生成素TSLP是一种特殊的B细胞相关细胞因子，该分子类似IL-7，具有一个4-螺旋花束样结构，大小为140个氨基酸。最初的研究表明该因子能够支持B细胞发育，而进一步的研究则表明TSLP能够激活DC，并诱导Th2型细胞分化，从而促进特异性IgA分泌性B细胞的生成［3］。最近有研究证明利用TSLP作为黏膜佐剂，能够同时提高针对HIV gp140蛋白的黏膜以及系统免疫反应［4］。该结果提示TSLP具有开发为HIV黏膜疫苗佐剂的潜力。HIV表面的包膜蛋白gp120是病毒受体结合蛋白，也是中和抗体识别的主要靶点［5］。最近结束的泰国HIV疫苗临床实验表明，针对HIV-1包膜蛋白gp120可变区V1/V2的抗体反应与疫苗保护效果具有正相关性［6］。本研究通过构建鼠TSLP-V1/V2融合表达载体，成功表达了具有V1V2抗原表位的抗原-佐剂融合蛋白，为深入研究HIV-1 V1/V2亚单位黏膜疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌菌株DH5α由本室保存。真核表达质粒pCEP-Pu由意大利国家癌症研究所Maurizio Mongiat博士惠赠。HIV-1 V1/V2BAL基因序列经密码子优化后，由Genescript公司合成，克隆于pUC57载体中。鼠TSLP基因质粒由日本佐贺大学医学部Kazuhiko Arima博士惠赠。293F细胞以及FreeStyle 293表达培养基购自Life Technologies公司。限制性内切酶 NheⅠ，XhoⅠ，T4 DNA连接酶，预染蛋白分子量标准购自Thermo公司。DNA聚合酶PrimeSTAR与DNA产物纯化回收试剂盒购自TaKaRa公司。质粒DNA提取纯化试剂盒购自Promega公司。转染试剂Polyethylenimine（PEI）购自Polyscience公司。Anti-His-tag鼠单克隆抗体购自Abmart公司。羊抗鼠，羊抗兔荧光二抗以及Odyssey封闭缓冲液购自LI-COR公司。碱性磷酸酶标记的羊抗人二抗购自 ZYMED。ELISA显色底物pNPP购自Sigma。用于His标签亲和纯化的Swell-Gel nickel chelate discs与BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce。HIV-1阳性病人血清由北京佑安医院吴昊教授提供。其余试剂为国产分析纯试剂配制。

1.2 方法

1.2.1 mTSLP-V1/V2BAL重组质粒构建 采用overlapping PCR方法构建mTSLP-V1/V2BAL基因融合片段。第一轮PCR分别扩增mTSLP基因（GenBank No.NM021367）与 HIV-1 V1/V2BAL基因片段（Gen-Bank No.AY426110），其中使用引物对 1（5'-CTAGCTAGCGTACAACTTTTCTAACTGC-3'，5'-CCGCCGCCGCTTCCGCCTCCGCCGCTGCCTTCTGGAGATTGCATG-3'）扩增mTSLP基因编码区序列（20～140 aa），去除了mTSLP自身的信号肽序列，在其5'端引入NheⅠ酶切位点，在其3'端引入长度为14 aa的glycine-serine linker序列（GSGGGGSGGGGSGS）;使用引物对2（5'-GCGGAAGCGGCGGCGGAGGCAGCGGCAGCCTGAAGCCCTGCGTG-3'，5'-CCGCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3'）扩增HIV-1 V1/V2BAL基因片段，在其5'端引入 glycine-serine linker的互补序列，在其3'端引入6×His标签与XhoⅠ酶切位点。第一轮PCR扩增参数:98℃，10 s;55℃，15 s;72℃，30 s;30个循环;72℃，5 min。1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，割胶回收纯化目的片段。第二轮PCR使用上述回收纯化的目的片段作为模板，使用引物对1的正向引物和引物对2的反向引物进行扩增，融合mTSLP与V1/V2BAL。第二轮PCR扩增参数:98℃，10 s;55℃，15 s;72℃，1min;30个循环;72℃，5min。1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，割胶回收纯化融合基因片段。使用限制性内切酶NheⅠ、XhoⅠ分别酶切mTSLP-V1/V2BAL基因片段与pCEP-Pu质粒，胶回收载体片段，T4 DNA连接酶将目的片段与载体片段进行连接，转化DH5α感受态细胞，挑取重组克隆，通过酶切与测序验证后，将该重组蛋白质粒命名为pCTV1V2BAL。

1.2.2 mTSLP-V1/V2BAL重组蛋白在 293F 细胞中的表达 使用293F悬浮细胞表达重组蛋白［7］，具体步骤如下:①转染前一天以（0.6～0.7）×106cells/ml密度接种细胞，转染当天细胞密度应达到（1.2 ～1.5）×106cells/ml，细胞状态良好，多数呈单个散在细胞的形式存在，其细胞活力达95%以上。②稀释细胞至1×106cells/ml。③使用1/10转染体积的FreeStyle 293培养基稀释质粒，混匀后加入PEI，轻吹混匀，室温孵育 15～20 min（PEI与Plasmid的转染终浓度分别为2μg/ml与1μg/ml）。④将转染复合物缓缓加入细胞培养物中，同时轻摇混匀。⑤放回培养箱继续培养。转染后无需更换培养基。⑥转染后第6天收集培养物，用于蛋白纯化。

1.2.3 重组蛋白纯化 因为mTSLP-V1/V2BAL重组蛋白N端融合有BM40信号肽［8］，其主要成分为分泌型蛋白。利用其 C端带有 his-tag标签，使用Pierce SwellGel nickel chelate discs进行纯化。具体方法如下:①将过滤后的细胞上清液的pH值调至7.0左右。②加入一颗disc，混合均匀后，室温结合2 h，1 500 r/min离心5 min，弃上清液。③加入1 ml洗涤缓冲液（50 mmol/L Na3PO4，300 mmol/L NaCl，30 mmol/L 咪唑，pH7.4），室温颠倒混匀 5 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清液。重复洗涤4次以去除杂蛋白。④加入200μl洗脱缓冲液（50 mmol/L Na3PO4，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L 咪 唑，pH 7.4），室温颠倒混匀5 min，1 500 r/min 离心5 min，收集上清液。重复洗脱2次，合并洗脱产物。

1.2.4 重组蛋白的 SDS-PAGE分析以及 Western blot鉴定 将纯化蛋白与未转染细胞上进行SDSPAGE分离。电泳胶组成为5%浓缩胶，10%分离胶。用非还原上样缓冲液上样，60 V电泳30 min，将电压调至120 V，电泳至指示剂前沿到达胶底。用去离子水漂洗3次，每次5 min，考马斯亮蓝R250染液室温染色1 h。去离子水漂洗后，使用Odyssey红外成像系统扫描结果。

另外准备样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转印到PVDF膜后，Odyssey封闭缓冲液室温封闭1 h，一抗分别用anti-his鼠单克隆抗体（1∶500稀释）和anti-TSLP兔多克隆抗体 （1∶200稀释），4℃孵育过夜，0.1%PBST洗涤10 min，3次。二抗采用荧光标记的羊抗鼠和羊抗兔抗体（均为1∶15 000稀释），室温孵育1 h。0.1%PBST洗涤10 min，3次。Odyssey红外成像系统扫描结果。

1.2.5 重组蛋白与HIV-1阳性病人血清的反应利用 ELISA检测 mTSLP-V1/V2BAL重组蛋白上的HIV-1抗原表位。具体步骤如下:①使用BCA蛋白定量试剂盒定量重组蛋白。②使用碳酸盐缓冲液（pH9.6）包被250 ng蛋白于96孔聚乙烯微孔板，4℃孵育过夜。③0.05%的PBST洗涤5遍，4%脱脂奶粉封闭，37℃孵育1 h。④0.05%的PBST洗涤5遍，4%脱脂奶粉稀释 HIV-1阳性病人血清（1∶1 000稀释），37℃ 孵育 1 h。⑤0.05% 的 PBST洗涤5遍，4%脱脂奶粉稀释碱性磷酸酶标记的羊抗人二抗（1∶1 000稀释），37℃孵育1 h。⑥0.05%的PBST洗涤5遍，加入pNPP底物，37℃孵育20 min，检测OD405值。

2 结果

2.1 mTSLP-V1/V2BAL重组质粒构建 PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳分离后，分别显示402、356、742 bp的特异性扩增条带，与预期结果一致（图1）。

将重组质粒pCTV1V2BAL进行NheⅠ、XhoⅠ双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳，在750 bp位置出现目标片段（图2）。使用通用测序引物对重组质粒进行测序，结果表明与GenBank登陆的序列完全一致，未出现突变或移码。

2.2 SDS-PAGE电泳和 Western blot检测结果mTSLP-V1/V2BAL重组融合蛋白含有231个氨基酸，其V1/V2部分长度为98个氨基酸，其序列上包含5个N-连接糖基化位点，根据理论推测融合蛋白的表观分子量约为41～50 kD。纯化后的mTSLP-V1/V2BAL蛋白经SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色后，在40 kD处出现了目标条带，与预测结果基本一致（图3）。分别使用anti-TSLP兔多克隆抗体和antihis鼠单克隆抗体检测重组蛋白的表达，均能在35 kD至55 kD范围内检测到一条不均一的糖蛋白条带，说明该融合蛋白N端的TSLP与C端的V1/V2均得到正确的表达（图4）。

图1 m TSLP-V1/V2BAL的over-lapping PCR扩增结果Fig.1 Over-lapping PCR results ofm TSLP-V1/V2BAL

图2 重组质粒pCTV1V2BAL的酶切鉴定图谱Fig.2 Restriction analysis of recombinant plasm id pCTV1V2BAL

图5 重组蛋白m TSLP-V1/V2BAL的ELISA分析Fig.5 ELISA reaction profiles of m TSLP-V1/V2BAL protein w ith a panel of human sera

2.3 ELISA检测结果 为检测重组蛋白是否具有正确的V1/V2抗原表位，使用ELISA分析HIV-1阳性病人血清对其的结合反应。结果表明9份HIV-1阳性病人血清均能识别重组蛋白，而HIV-1阴性血清与重组蛋白没有反应（图5）。该结果说明mTSLP-V1/V2BAL具有HIV-1 V1/V2结构域的天然抗原表位。

3 讨论

HIV-1作为主要通过黏膜传播的病原体，其传播过程中首先面对的就是黏膜表面各种物理屏障以及黏膜免疫系统的阻挡。当黏膜暴露于HIV-1后，只有少量的病毒颗粒能够穿过黏膜层建立初始感染。最初感染的靶细胞是位于黏膜层激活的CD4+T淋巴细胞。病毒库的初始建立视为急性感染的开始，随后病毒的复制导致肠道黏膜层的淋巴细胞急剧减少［9］。肠道黏膜层的破坏会导致细菌迁移以及长期的免疫激活，这导致宿主逐渐进入免疫缺陷的进展期。宿主的免疫反应可以控制病毒的复制但是却无法彻底清除病毒。因此，利用黏膜疫苗诱导黏膜免疫系统产生保护性的免疫反应，阻断HIV病毒的传播，这是一个很有潜力的疫苗开发策略。

当传统的蛋白质免疫原应用于黏膜免疫时，经常会遇到免疫原性弱或无免疫应答的情况，所以寻找合适的黏膜免疫佐剂是HIV-1黏膜疫苗成功的前提。TSLP是一种主要由上皮细胞分泌的细胞因子，通过激活DC细胞，TSLP能够诱导Th2型炎症反应［3］。Van Roey等［4］报道，利用 TSLP 作为黏膜佐剂，通过鼻腔免疫的方式，能够在小鼠上诱导针对HIV-1 gp140蛋白的特异性抗体反应，而且该反应同时出现在黏膜以及血清中，其免疫反应强度与经典的黏膜佐剂霍乱毒素（Cholera toxin，CT）相当。TSLP可能通过直接激活鼻黏膜内的DCs，促使其摄取HIV-1 gp140蛋白，然后通过激活Th细胞，诱导B细胞的激活与分化。此外，TSLP能够与TCR刺激协同作用，直接激活幼稚CD4+T细胞，促进Th2细胞的分化、增殖以及Th2效应细胞的存活［10，11］。因此，TSLP具有诱导保护性黏膜免疫反应的潜在能力，其作为HIV-1黏膜疫苗佐剂的应用值得进一步的研究。

长期以来的观点认为，保护性HIV-1疫苗应该能够诱导广谱中和抗体反应［12］。被动保护实验已经证明广谱中和抗体能够阻止SHIV感染灵长类动物模型［13］。进一步的研究则表明被动转移的中和抗体能够在停止抗病毒治疗的个体内延迟HIV-1病毒的反弹［14］。最近在人源化小鼠动物模型的研究证明，利用基因治疗的手段导入并表达中和抗体，能够提供类似于疫苗的保护效果［15］。Bomsel等［2］人利用gp41亚单位病毒样颗粒疫苗，在灵长类动物体内诱导出保护性黏膜抗体反应。泰国RV144疫苗实验结果表明针对V1/V2的IgG抗体与疫苗保护效果具有相关性［6］。之前的研究结果表明，针对V1/V2抗原表位的抗体通常出现在感染早期，而且由于该区域的高度变异性，针对V1/V2抗体通常是亚型特异性的［16］。但最新分离的一系列广谱中和抗体（PG9、PG16、PGT145）均是针对V1/V2的保守结构域［17，18］，这充分证明了 V1/V2 区域作为保守中和抗体靶点的重要意义。我们之前的研究表明，真核表达的重组V1/V2蛋白具有正确的蛋白构象以及抗原表位［19］。因此在本研究中，利用239F悬浮细胞蛋白表达系统，我们成功构建了具有正确构象的HIV-1 V1/V2-佐剂融合蛋白，该蛋白分泌表达，纯化方法简便，可以进一步用于黏膜免疫实验，诱导针对V1/V2中和表位的保护性抗体反应。

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［收稿2013-10-05 修回2014-01-16］

（编辑 倪 鹏）

Eukaryotic expression and characterization ofmouse TSLP and HIV-1 gp120BALV1/V2 fusion protein

CHUYing，WANGTing-Ting，RUIYu-Wen，SONGSi-Wei，SUAi-Rong，CHENGLin，SONGHong-Yong，ZHENGDa-Tong，WUZhi-Wei.CenterforPublicHealthResearch，MedicalSchool，NanjingUniversity，Nanjing210093，China

Objective:To express fusion protein ofmouse thymic stromal lymphopoietin（TSLP）and HIV-1 gp120BALV1/V2 subdomain in 293F cell.Methods:Full length of the V1V2 sequence from BAL isolatewas fused with the C-terminus ofmouse thymic stromal lymphopoietin（TSLP）and sub-cloned into pCEP-Pu vector to construct the eukaryotic expression plasmid-pCTV1V2BAL.The recombinant plasmid was confirmed by enzyme digestion and sequencing，then transfected into 293F cells using PEIas a transfection reagent.The fusion protein was purified by metal chelate affinity chromatography and characterized by SDS-PAGE and Western blot.The epitopes of V1/V2 in fusion protein were identified by ELISA.Results:The SDS-PAGE and Western blot results showed that there were highly heterogeneous glycoprotein bands at the site between 35 kD and 55 kD，which reacted with anti-mTSLP rabbit polyclonal antibody and anti-His tagmousemonoclonal antibody.The ELISA analysis showed that antibodies to V1/V2BALexisted in the sera of HIV-1 positive patients.Conclusion:ThemTSLP-V1/V2 fusion protein was successfully expressed in 293F cells，whichmay be useful for HIV-1 vaccine research.

HIV-1;gp120 V1/V2;TSLP;293F expression system;Fusion protein

R392.11

A

1000-484X（2014）05-0582-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.002

①本文为国家自然科学基金面上项目（No.30870124），科技部国际合作项目 （No.2009DFA31260）的资助。

②南京医科大学附属第二医院，南京210011。

③通讯作者，E-mail:wzhw@nju.edu.cn。

楚 鹰（1979年－），男，博士，主要从事HIV-1分子免疫学方面研究。