痰瘀同治对大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响*

薛金贵 王玉琦 郭 炜 高俊杰 兰德辉 沈智杰 戎靖枫 陈铁军 王肖龙 周 华

（上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203）

动脉粥样硬化（AS）斑块的产生和发展是造成血管狭窄的主要因素，而斑块的不稳定甚至破裂是引起急性冠脉综合征（包括不稳定型心绞痛和心肌梗死）的罪魁祸首。已有研究提示AS斑块的形成与炎细胞浸润、内皮细胞破坏，血管平滑肌细胞（VSMC）增殖、迁移等有关。中医药对延缓或逆转AS斑块进展的研究尚不多。近年来研究发现，痰瘀互结是许多冠心病患者的主要病机，痰瘀同治可明显缓解心绞痛。丹蒌片是痰瘀同治的代表方剂，在治疗冠心病、稳定AS斑块等方面有较为显著的疗效，但机制尚不清楚。本实验通过体外培养血管平滑肌原代细胞，血小板衍生因子BB型（PDGF-BB）诱导其增殖，通过MTT法观察中成药丹蒌片药物血清作用下，VSMC增殖的情况，并阐述其可能机制。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 动物 雄性 SD 大鼠，体质量（180±20） g，6～8 周龄，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物合格证号 SCXK（沪）2008-0016。

1．2 仪器与试药 细胞培养箱（德国Heraeus公司，型号HERAcell150）；倒置生物显微镜（重庆光电）；超净台（苏州安泰空气净化有限公司，型号BHC-1300IIA/B3）；流式细胞仪（BD FACSCalibur E97501326）；酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；荧光显微镜（Olympus美国）；离心机（eppendorf美国）。 DMEM（低糖）培养基、PBS、FBS、0．25%胰酶（corning cellgro USA，均购自上海普飞生物技术有限公司）；青霉素、链霉素、二甲基亚砜、细胞固定液、细胞封片液、一抗稀释液、二抗稀释液、抗小鼠-FITC免疫荧光试剂盒、α-actin SM specific一抗、RNASE、PI、MTT粉末 （均购自上海碧云天生物技术有限公司）。

1．3 含药血清制备 丹蒌片（吉林康乃尔药业有限公司）置于研钵中磨粉，精密天平称取18．8 g溶于200mL无菌注射用水中，磁力搅拌20min，充分溶解，过200目筛网去渣，置于4℃冰箱备用。根据人和大鼠剂量换算，治疗组每日药物灌胃1mL/100 g，对照组不做处理。2周后腹主动脉取血。全血20℃，3000 r/min，离心15min， 取血清，56℃、30min 水浴灭活，0．22μm 针式过滤器滤菌，置-20℃冰箱保存备用。

1．4 原代细胞培养 对照组大鼠取胸主动脉进行原代细胞培养。贴壁法培养原代胸主动脉平滑肌细胞。3 d后可见较多圆形透亮细胞，5～6 d换液，可见组织块周围有梭状细胞爬出，此后换用10%FBS培养液，2～3 d换液1次，继续培养1周左右，镜下可见细胞呈“峰-谷”样排列，待平滑肌细胞铺满培养瓶。

1．5 细胞传代、纯化及保存 当培养瓶底部长满细胞后，可进行细胞传代。传代时，将消化吹打形成的细胞悬液静置15min，使部分成纤维细胞贴壁，轻轻翻转培养瓶，将培养液转移至另一个培养瓶中，再次静置、贴壁，重复上述步骤1～2次，几次传代后可获较纯的平滑肌细胞。当细胞传至第3代时，可进行细胞冻存。装入冻存管中，置4℃冰箱中2 h，-20℃冰箱中放置1 h，-80℃冰箱中长期保存。

1．6 胸主动脉平滑肌细胞鉴定 细胞以1×106个/mL种于6孔板中，孔内预先置入细胞培养用盖玻片。待细胞长置80%满时，去培养液，加入固定液，作用15min，去固定液，加封闭液，置培养箱中封闭1 h。去封闭液，加洗涤液，洗涤 3遍，每次 15min。加入一抗（1∶1000稀释），培养箱中作用1 h，一抗为actin抗体。回收一抗，洗涤液洗涤3遍，避光加入二抗（1∶400稀释），培养箱中避光作用1 h，二抗为抗小鼠FITC。回收二抗，加抗荧光猝灭封片液，置荧光显微镜下观察、拍照。镜下可见鲜绿色与细胞长轴平行的肌丝。

1．7 四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测药物血清对正常VSMCs的影响 分为5组：DMEM组 （空白对照组）、DMEM+N 组 （DMEM+10%正常血清）、DMEM+L组 （DMEM+10%低浓度药物血清）、DMEM+M组（DMEM+10%中浓度药物血清）、DMEM+H组（DMEM+10%高浓度药物血清），每组设6个副孔。将细胞以1×104个/mL种于96孔板中，次日去培养液，加入DMEM培养24 h进行细胞同步，将细胞周期同步于G0/G1期，按照分组加入药物血清，分别于培养箱中培养24、48、72 h，后去培养液加入5mg/mLMTT 10μL和DMEM 90μL，培养箱中反应3～4 h。吸去MTT液，每孔加二甲基亚砜（DMSO）150 μL，振荡 15min，使结晶溶解，置酶标仪，570 nm波长下测吸光度值。

1．8 MTT法检测药物血清对PDGF-BB诱导的VSMC增殖的影响 实验方法同正常血管平滑肌。分为5组：DMEM+P 组 （DMEN+PDGF-BB）、DMEM+P+N 组（DMEM+PDGF-BB+10%正 常 血 清 ）、DMEM+P+L 组（DMEM+PDGF-BB+10%低浓度药物血清）、DMEM+P+M组 （DMEM+PDGF-BB+10%中浓度血清血清）、DMEM+P+H组 （DMEM+PDGF-BB+10%高浓度血清血清），每组设 6 个副孔。分别培养 24、48、72 h。570 nm波长下测试OD值。

1．9 统计学处理 应用SPSS13．0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用独立样本t检验、单因素方差分析。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 原代平滑肌细胞培养及形态学观察 见图1。原代培养中，组织块贴壁后5～7 d，可见少量细胞自组织块边缘游出，未成功贴壁的组织块则无细胞爬出。细胞渐向外生长形成细胞簇，细胞形态多样（梭形、多角形、星形或不规则形），大小不等。此后细胞呈放射性生长，至培养2周左右局部成束的细胞平行排列，部分区域细胞多层重叠，部分区域高低起伏呈“峰-谷”状生长。待细胞长满可进行传代，90%以上细胞可重新贴壁，生长方式及形态特点同前。

图1 第3代大鼠VSMC

图2 VSMCα-actin肌动蛋白免疫荧光染色

2．2 VSMCs组织学鉴定 见图2。待VSMCs传至第3代，可进行细胞免疫荧光鉴定。透过荧光显微镜，可见VSMCs肌丝呈鲜绿色，与细胞长轴平行排列，表示α肌动蛋白呈阳性表现。

2.3 丹蒌片对正常VSMCs增殖活性的影响 见表1。与DMEM比较，各组VSMCs在不同培养时间都有非常显著增殖（P＜0.01）。不同浓度药物血清组与正常血清组相比，无显著差异（P＞0.05）。不同浓度药物血清组之间比较无显著差异（P＞0.05）。

表1 丹蒌片对正常平滑肌细胞增殖抑制作用OD值比较（±s）

表1 丹蒌片对正常平滑肌细胞增殖抑制作用OD值比较（±s）

与DMEM组同时间比较，**P＜0.01；与DMEM+L组同时间比较，#P＜0.01。

组别 n 72 h DMEM 组 6 0.656±0.170 DMEM+N 组 6 2.124±0.290**DMEM+L 组 6 1.839±0.136**24 h 48 h 0.647±0.071 0.552±0.077 1.600±0.102**1.756±0.027**1.545±0.067**1.802±0.046**DMEM+M 组 6 2.128±0.155**#1.597±0.044**1.732±0.077**DMEM+H 组 6 1.642±0.071**1.797±0.101**2.272±0.302**#

2.4 丹蒌片对PDGF-BB诱导VSMCs增殖活性的影响 如表2。与DMEM+P相比，各组均有非常显著差异（P＜0.01）。与正常血清组相比较，24 h低、中浓度血清组与72h各浓度血清组均有差异（P＜0.05）；24 h高浓度血清组与48 h各浓度血清组均有极显著差异（P＜0.01）。与低浓度血清组比较，48 h高浓度血清组有显著差异（P＜0.05），24 h高浓度血清组有非常显著差异（P＜0.01）。

表2 丹蒌片对PDGF-BB刺激下平滑肌细胞增殖抑制OD 值比较（±s）

表2 丹蒌片对PDGF-BB刺激下平滑肌细胞增殖抑制OD 值比较（±s）

与DMEM+P组同时间比较比较，**P＜0.01；与DMEM+P+N组同时间比较，#P＜0.05；与 DMEM+P+N 组同时间比较，△P＜0.01；与 DMEM+P+L 组同时间比较，▲P＜0.01；与 DMEM+P+L 组同时间比较，□P＜0.05。

组 别 n 72 h DMEM+P 组 6 1.670±0.158 DMEM+P+N 组 6 3.723±0.179**DMEM+P+L 组 6 3.539±0.078**#24 h 48 h 1.097±0.183 1.625±0.092 1.865±0.048** 2.855±0.079**1.780±0.056**# 2.695±0.085**△DMEM+P+M组 6 3.487±0.145**#1.747±0.098**# 2.658±0.052**△DMEM+P+H 组 6 1.685±0.037**△▲ 2.594±0.050**△□ 3.481±0.168**#

3 讨 论

本实验选用PDGF-BB作为诱导平滑肌增殖诱导剂。PDGF-BB是一种强烈的细胞丝裂原，可通过激活多条信号通路而调节功能蛋白的磷酸化状态和相互作用关系，最终抑制或激活靶基因的表达［1-2］。研究发现PDGF-BB通过诱导VSMCs表型转化致使在不同浓度的PDGF-BB刺激下VSMC活力呈时间、剂量依赖性提高，在PDGF-BB影响下，处于G0/G1期VSMC细胞明显减少［3］。

AS是多种因素相互作用的复杂过程［4］。典型AS病变多发生在大动脉和中动脉，在包括脂质等多种因素的作用下，VSMC可由收缩型转变为合成型［5］。合成型的VSMC较收缩型细胞更易于迁移、增殖［6］。在AS晚期，VSMC在炎症因子作用下，表型发生改变，增殖并向内膜下迁移，吞噬ox-LDL成为泡沫细胞。坏死泡沫细胞及组织碎片形成病变深部糜粥样柔软部分，突出于管腔表面，覆以较坚硬的纤维被膜。硬化斑块的纤维帽结构的发生发展主要是VSMC的迁徙、增殖及基质的沉积，导致动脉管腔的狭窄。不稳定斑块发生破裂，可造成血栓而导致严重不良后果。本实验将血管平滑肌细胞作为研究对象，通过抑制平滑肌细胞的增殖，从一定程度上改善动脉粥样硬化的发生和发展。本研究发现，与正常血清组比较，丹蒌片各浓度药物血清组培养24、48、72 h OD值均有降低，提示丹蒌片药物血清可抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖。

丹蒌片组方立足于痰瘀同治理论，全方由瓜蒌皮清热化痰、利气宽胸，薤白通阳散结，二者相合，化痰散结，行气导滞，共为君药。臣以丹参活血凉血、赤芍清热凉血、川芎活血行气、葛根益胃生津，共奏活血化瘀、通络止痛之功。佐以黄芪补气升阳、泽泻利水渗湿，以郁金活血行气、开郁止痛，骨碎补活血补肾为使。全方化痰散结，补气活血，补而不滞，伐而不过。药理研究发现，瓜蒌可扩张冠状动脉增加血流量，提高耐缺氧能力，降低血清胆同醇，抗菌、抗癌等多种作用［7］。丹参中包含丹参酮类、丹参酚酸类，对循环系统也有扩冠、增加血流、减少氧耗的作用［8］。在既往实验研究和临床研究的基础上，证实丹蒌片具有抑制VSMC增殖的作用，为丹蒌片抗AS提供了新的证据。

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［2］ 谢良地，陈海峰，许昌声.阿魏酸钠对血管平滑肌细胞热休克蛋白27磷酸化的影响［J］.中国病理生理杂志，2008，24（12）：2352-2355.

［3］ 高蕊，董丽华，谢肖立，等.PDGF-BB对血管平滑肌细胞表型标志物表达的影响［J］.中国病理生理杂志，2010，26（12）：2301-2305

［4］ 吴先杰，王永霞.动脉粥样硬化发生机制研究现状及思路［J］.中华实用诊断与治疗杂志，2012，26（7）：629-631.

［5］ Nataliya A，Pidkovka，Olga A，et al.Oxidized phospholipids induce phenotypic switching of vascular smooth muscle gells in vivo and in vitro ［J］.Circulation Research，2007（101）：792-801.

［6］ Gary K.Owens， Meena S.Kumar， Brian R.Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Developmentand Disease［J］.PhysiolRev，2004（84）：767-801.

［7］ 洪铁，杨振，刘玉梅，等.丹蒌片对高脂血症大鼠血管内皮功能的影响［J］.世界中西医结合杂志，2010，4（6）：308-310.

［8］ 柴瑞震.丹参的药理研究近况［J］.中国中医药科技，2003，10（6）：390.