淫羊藿苷对急性大脑中动脉梗死大鼠SDF-1及其受体CXCR-4的影响*

马 立 吴明华 韩 漾 梁 森

（1.南京中医药大学，江苏 南京 210029；2.江苏省中医院，江苏 南京 210029）

淫羊藿苷是从淫羊藿中提取的异黄酮类化合物，其结构与内源性神经生长因子酪氨酸激酶（TrkB）受体激动剂类似。Trk受体表达增加，是内源性神经保护机制之一，其有助于挽救濒死的神经细胞［1］。本研究采用其类似结构的淫羊藿苷进行研究，一方面可以为中医药治疗中风的作用机制进行探索，另一方面试图为淫羊藿苷成为有效的神经保护成分提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 动物及模型制备 健康清洁级雄性SD大鼠 （由上海市动物实验中心提供），体质量（250±30）g，共 24只，随机选取18只采用线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶性缺血（MCAO）模型［2］，剩余 6 只手术步骤同 MCAO模型鼠，但只分离、暴露血管，不结扎颈总动脉及颈外动脉，不插入栓线。随机将MCAO大鼠分为低剂组6只、高剂量组6只、模型对照组6只，经24 h后分别通过灌胃给药法每日给予0.9%氯化钠注射液（模型对照组）及淫羊藿苷溶液，其中低剂量组淫羊藿苷30mg/kg，高剂量组淫羊藿苷60mg/kg。

1.2 神经功能评分 各组随机选取3只作为14 d处死大鼠，对其采用神经功能缺损评分标准（NSS），每组于术后2 h，1 d，7 d，14 d进行评价。具体评分标准如下：无任何异常行为，0分；提起鼠尾，健侧前肢内旋、肩内收为损伤较轻，1分；上述症状基础上，置于光滑平面，向健侧推挡时阻力减弱或动物转圈追尾爬行，为中度损伤，2分；提起鼠尾，向患侧旋转，损伤较严重，3分；动物处于精神抑制状态，不能进行自发活动，4分。0分及 4分的大鼠不予入组［2］。

1．3 荧光定量RT-PCR检测 以神经功能评分改善最佳的组作为有效组，以模型组为参照。（1）组织总RNA的抽提。分别取损伤周边部位和侧脑室部位脑组织液氮冷冻，利用TRizol方法（Invitrogen公司提供）提取总RNA。（2）逆转录cDNA。将cDNA合成试剂盒（Fermentas）从-80℃冰箱取出，复融，等量取上述标本所提取的总RNA各1mL，分别转录生成cDNA，反应体系（总体积19μL）包括：作为模版的总RNA 4μL；Oligo（dT）。 0．5 μL）；加去离子水至总体积为 9 μL。 上述溶液置70℃，5min，然后放入冰水中冷却，再加入5×RT 反应缓冲液 4μL，dNTP 混合液 0．5μL， 加去离子水（去RNA酶处理），至总体积为19；上述溶液置于37℃水浴5min，然后加人逆转录酶MMLV 1μL，37℃孵育60min，然后加热至95℃ 5min，置冰水中冷却。（3）Real-time PCR。将制备好的cDNA进行PCR扩增，PCR 引物序列如下。 CXCR-4：P1：5′-GTTGCCTGAAC CCCATCCTCTA-3′。 P2：5′-GTGTCCACCCCGTTTCCCTTTG-3′。扩增长度：126bp。SDF-1：P1：5′-AGATGC CCCTGCCGATTCTTTG-3′。 P2：5′-TGTTGTTGCTTT T CAGCCTTGC-3′。 扩增长度：118bp。 b-actin：P1：5′-CTAAGGCCAACCGTGAAAAGAT-3′。P2：5′-ACCAGA GGCATACAGGGACAAC-3′。扩增长度：104 bp。扩增体系如下：SYBRGreen Mix 32．5 μL，上游引物 F 0．5 μL，下游引物 R 0．5μL，dd H2O 水 14．5μL，cDNA 模板 2μL，总体积 50μL， 在 Real-time检测仪 （7500 Sequence Detection System）（ABI-7500，美国）进行 DNA 聚合反应，反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性15 s，60℃退火35 s，40个循环后自动停止，模版内含目的基因可直接读出。

1．4 统计学处理 应用SPSS13．0统计软件。数据均以（±s）表示，采用单因互方差分析，再用LSD法进行两组之间均数比较。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 各组神经功能评分结果 模型对照组在术后1 d，神经功能缺损达到高峰，随后有所缓解，这可能与其自愈功能有关。给药组神经功能缺损均有所改善，高剂量组与模型组神经功能评分差异无统计学意义 （P＞0．05），低剂量组在14 d时结果差异有统计学意义（P＜0．05），根据实验结果，选取模型对照组、低剂量组为有效组进行进一步基因检测。

2．2 基因检测结果 在第7日，低剂量组随比模型组基因量增多，但差异不具有统计学意义；而在第14日，低剂量组大鼠梗死灶中SDF-1、CSCR-4的基因量显著大于模型组，且具有统计学差异（P＜0．05)，由此可推断，淫羊藿苷的起效时间或在7～14 d左右。

表1 各组大鼠个时间点神经功能缺损评分比较（±s）

表1 各组大鼠个时间点神经功能缺损评分比较（±s）

与模型对照组同时期比较，△P＜0．05，△△P＜0．01。 下同。

组 别 n 2 h 1 d 7 d 14 d低剂量组 6高剂量组 6模型对照组 6 3．0±0．0 2．7±0．6 1．7±0．6 1．0±0．0△2．7±0．6 2．3±0．6 2．3±0．6 1．7±0．6 2．7±0．6 3．0±0．0 2．3±0．6 2．3±0．6空白对照组 60 0 0 0

表2 大鼠SDF-1/CXCR-4基因量检测结果（±s）

表2 大鼠SDF-1/CXCR-4基因量检测结果（±s）

组别 SDF-1 CXCR-4模型对照组 7 d 0．176±0．056 0．023±0．004（n＝6） 14 d 0．130±0．020 0．016±0．002低剂量组 7 d 0．185±0．042 0．024±0．007（n＝6） 14 d 0．160±0．019△△ 0．019±0．002△

3 讨 论

中医学将脑梗死其归于 “中风”、“偏枯”、“类中”、“卒中”等范畴，多因脏腑功能失调，元气耗伤，忧思恼怒等使淤血阻滞，痰热内蕴，阳化风动，血随气逆而上犯于脑，终致脑脉瘀滞所致［3］。 《内经》云“阳气者，大怒则形色绝，而血苑于上，使人薄厥”。中风病是一种多种致病因素长期作用于人体导致的疾病，其病因病机存在着复杂多变的特性，单以一种观点难以把握中风病的整体病因病机变化。目前公认中风病存在6种常见的病理因素：虚（阴虚、血虚）、火（肝火、心火）、风（肝风、外风）、痰（风痰、湿痰）、气（气滞、气逆）、瘀（血瘀）［4］。近年来随着对中风病因病机认识的不断加深，中风之证发现有阳气不足者。蔡剑英等自制中风康复丸治疗中风半身不遂36例，结果总有效率94．4%，该方中已提到淫羊藿具有改善循环的作用［5］。《内经》也提出“脑为髓之海，而肾主骨生髓”，而中医学之“肾生髓”理论也与神经系统密切关系。

淫羊霍味辛甘，性温，入肝肾二经，功擅补肾壮阳，祛风除湿。朱良春教授常谓“仙灵脾温而不燥，为燮理阴阳之佳品”。淫羊藿苷为中药淫羊藿干燥茎叶的提取物，结构上属于8-异戊烯基黄酮醇苷类化合物。现代药理学研究证明，淫羊藿苷对神经血管保护具有多重方面的效应，主要表现在以下几个方面。（1）抗缺血性脑损伤。可显著增加脑血流量，降低脑血管阻力；增强超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）活性，抗氧化；抑制线粒体肿胀，保护脑线粒体呼吸链；在体外刺激血管内皮细胞的增殖，迁移和血管生成，也可能直接刺激血管生成［6-7］；（2）炎症反应。有相关实验通过培养离题的小胶质细胞发现，淫羊藿苷具有明显抑制NO、前列腺素（PGE）-2 活性氧（ROs）的释放及促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-β（IL-β）和IL-6的mRNA表达，而且淫羊藿苷剂量依赖性地抑制LPS所致的诱导型NOS、COX-2蛋白表达机制［8］。（3）抗痴呆、抗衰老。（4）抗抑郁作用。（5）降低血同型半胱氨酸（HCY），拮抗HCY诱导的血管内皮细胞凋亡，降低动脉硬化风险［9］。

缺血性脑梗死可直接导致神经组织破坏，引起神经功能障碍，且损伤后的脑组织肿胀、缺血，进一步影响周围组织，近年来对SDF-1及其受体CXCR-4在缺氧缺氧性脑损伤中的作用研究越来越受到人们的关注。SDF-1可以与其受体CXCR-4结合，形成SDF-1/CXCR-4信号轴，该信号轴在生物发育过程中发挥多种生物学功能，与胚胎发育、炎症反应、HIV感染、造血细胞调控以及干细胞的迁移等有密切关系。然而在缺血性脑梗死的过程中，该信号轴主要作用为3个方面。（1）SDF-1/CXCR-4信号轴调控内源性祖细胞迁移。目前已经有报道治疗中风的方法就是通过引进外源性神经祖细胞到脑组织内，这些细胞可能能够参与脑组织的修复过程。并且人们已经在中风导致脑损害的区域内发现表达CXCR-4的神经祖细胞，并且当SDF-1/CXCR-4信号轴受干扰后能够阻断这一募集反应［10］。说明该信号轴在脑损伤的过程中可以定向的调控神经祖细胞的迁移，从而帮助修复损伤的脑组织。（2）促进新血管的生成。有大量实验研究表明，SDF-1与血管内皮生长因子（VEGF）在促进新血管生成方面具有协同作用［11］，这种作用可能与内皮前提细胞的招募有关。（3）提高机体抗缺氧能力。

本实验中，通过建立大鼠MCAO模型，灌胃予不同剂量的淫羊藿苷，结果显示低剂量淫羊藿苷对大鼠急性脑梗死期的神经功能修复更为有效，将其作为有效组通过real-time PCR检测证实该该组可一定程度上调SDF-1、CXCR-4基因表达，进而笔者认为淫羊藿苷具有神经血管保护功能，这对在临床应用淫羊藿苷提供一定的实验室依据，在今后的实验研究中，笔者会针对淫羊藿苷在神经保护方面做进一步的探讨，淫羊藿苷或可成为新一代的神经血管保护剂存在。

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