补阳还五汤干预下骨髓间充质干细胞（MSCs）移植对于脑缺血大鼠神经修复的影响*

贾 妮 孙晓红

（陕西中医学院，陕西 咸阳 712000）

脑卒中是多种脑血管疾病的严重表现形式，具有极高的致残率和较高的致死率［1］。骨髓间充质干细胞（MSCs）用于脑中风和中枢神经退性行疾病等的治疗已经进行了很多的研究［2-4］。本研究试图观察中药复方补阳还五汤干预下MSCs移植对于缺血性大鼠模型神经修复的影响及机制。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 细胞提取及培养 选 Wistar大鼠 3只，4～6周龄，体质量（100±10）g，雌雄不限。大鼠麻醉后，从关节两端剪断股骨，将股骨中间剪断，用注射器吸取低糖DMEM培养液反复冲洗骨髓腔，冲出骨髓。制成单细胞悬液。将单细胞悬液离心，接种在培养瓶中，置培养箱中。利用差异贴壁培养法纯化细胞，按1∶3传代。用PBS洗涤细胞1～2次，加入trypsin-EDTA溶液，放入37℃培养箱2～3min，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用。补足3n（n为传代瓶数）mL培养基（MEM），依稀释比例转移至新的培养瓶中，放入CO2培养箱。

1．2 分组及造模 实验共分4组：空白组，假手术组，干细胞移植组及药物干预移植组。其中干细胞移植组及药物干预移植组均给予干细胞移植。模型制备方法包括10%水合氯醛溶液400mg/kg，腹腔注射麻醉动物。大鼠仰卧位固定，颈部正中切开皮肤，钝性分离各层组织，暴露右侧颈总动脉（CCA）。分离至颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）分叉后一段，置线备用。于颈内、颈总动脉处用动脉夹夹闭，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将尼龙线由颈外动脉插入，插入后用0号丝线结扎，打开颈内动脉处动脉夹，将尼龙线插入颈内动脉，插入深度约（18.5±0.5）mm至微感阻力，使尼龙线头端通过MCA起始处，到达较细的大脑前动脉，此时即实现右侧大脑中动脉的血流阻塞，结扎ICA以固定尼龙线和防止出血，尼龙线残端留1 cm长于皮外。假手术组只进行术前麻醉和血管分离术，不结扎及导入线栓。手术过程中室温保持在24～25℃。假手术组不插入尼龙鱼线，其余步骤同手术组。在缺血期间保持体温在（37±0.5）℃。模型成功的标志为以大鼠手术麻醉清醒后出现左侧肢体瘫痪，站立不稳，提尾时向一侧转圈为模型成功的判断标准。

1.3 干细胞移植 在MCAO模型制作后，立体定向注入BMSC干细胞，通过大鼠立体定向仪注入。24 h后重新麻醉，将其固定于立体定向架上，顶部正中切开皮肤，于前囟向左侧旁开2mm钻孔。将Hamilton微量注射器固定在立体定向架上，细胞在不少于10min内缓慢注射到左侧纹状体区 （AP=0mm，ML=2.0mm，DV=4.5mm）和大脑皮层（AP=0mm，ML=2.0mm，DV=2.0mm）。每只大鼠接受 10μL（5×104细胞/μL）移植细胞，其中纹状体区7μL，大脑皮层3μL，留针5min防止细胞逆流，拔出注射器，医用生物蛋白胶封闭注射针孔。

1.4 DiI荧光示踪剂标记 BMSCs细胞移植前以1000 r/min低速离心5min，收集细胞后避光加入5μM的DiI荧光示踪剂，避光室温孵育20min，PBS洗2次。调整细胞密度5×106个/100μL准备移植。

1.5 药物处理 补阳还五汤：黄芪120 g，当归6 g，芍药 5 g，地龙 3 g，川芎 3 g，红花 3 g，桃仁 3 g。 水煎 100 mL。按大鼠每日每千克体质量1.5 g计算药量。均于术前1 d及术后麻醉清醒后，每日分2次灌胃给药（2mL左右）或蒸馏水2mL，上、下午各1次。模型组和治疗组动物若有死亡，及时补充。

1.6 GAP-43定量Q-PCR的检测 提取总RNA，设计引物：上游引物5′-AGCTCTAGATGAAGCCAAACCT，下游引物：5′-ATCTGAGAAAGGGCAGGAGAGA。反应体系如下。cDNA：5μL上下游引物各0.5μL；2x SYBRGreen PCRMasterMix 10μL，加双蒸水至 20μL。PCR反应条件如下。预变性：95℃，5min。变性：95℃15 s，退火 60 ℃，15 s，延伸 72°3 s，共 40 个循环。 内参片段：GAPD Hr RNA-112 bp。目的片段：GAP-43-150 bp，溶解曲线分析温度60～95℃，

1.7 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间差异采用t检验。 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NSE阳性率分析 见表1。将石蜡包埋切片免疫荧光照相，将图片转成灰度图像，8位或精度更高的16位，32位。求Area的面积，求IOD的光密度值，计算IOD/Area（取2张片均值）。干细胞移植组与药物干预移植组在2、7 d时组间比较有显著差异（P＜0.05）。

表1 各组免疫荧光检测样品神经元阳性率（±s）

表1 各组免疫荧光检测样品神经元阳性率（±s）

与干细胞移植组比较，*P＜0.05。下同。

组 别 12 h 2 d 7 d空白组 1.02±0.03 1.15±0.03 1.02±0.03假手术组 0.92±0.03 1.04±0.09 1.03±0.08干细胞移植组 0.57±0.02 0.60±0.03 0.65±0.01药物干预移植组 0.68±0.03 0.85±0.03* 0.88±0.02*

2.2 各组缺血区GAP-43基因表达 见表2。检测不同组别3组GAP-43基因的Ct值，与内参基因片段GAPDHct值进行比较， 得出△Ct与△△Ct，△Ct=（目的基因Ct-内参Ct）的平均值±标准偏差；△△Ct=（待测样品中目的基因△Ct-参照样品中目的基因△Ct）的平均值±标准偏差。干细胞移植组与药物干预移植组比较，GAP-43基因表达12 h、2 d时增高，7 d时下降，组间比较有显著差异（P＜0.05）。

表2 各组缺血区GAP-43基因表达 （±s）

表2 各组缺血区GAP-43基因表达 （±s）

组 别 12h △Ct/△△Ct 2d △Ct/△△Ct 7d △Ct/△△Ct空白组 21.02±0.45 0±0.45 20.89±0.15-0.13±0.15 20.97±0.43-0.05±0.43假手术组 20.83±0.18-0.19±0.18 20±0.03 -1.01±0.03 19.87±0.05-1.15±0.05干细胞移植组 19.17±0.27-1.84±0.27 18.78±0.18-2.23±0.18 16.65±0.13-4.36±0.13药物干预移植组 17.48±0.14-3.54±0.14 15.98±0.14-5.03±0.14 18.59±0.41-2.43±0.41

3 讨 论

缺血性脑血管疾病多归属中医学“中风“范畴，益气活血化瘀法是治疗中风病重要及常用的治疗方法。骨髓间充质干细胞 （MSCs），作为神经移植的来源细胞，骨髓MSCs具有独特的优越性，GAP-43广泛分布于神经元内，在发育中的神经元沿整个轴突表达，在生长锥表达尤其丰富，是神经元发育和再生的一个内在决定因子，对突触的可塑性具有重要意义［2，5-9］。本研究显示缺血发生后，移植组7 d后GAP-43基因上调达到高峰，补阳还五汤干预下，2 d后GAP-43基因表达达到高峰，因此更早的促进神经修复的开始，而药物干预下各时间点，神经元阳性率都明显高于单纯移植组。

气虚与血瘀是中风病理过程中的关键证候因素。补阳还五汤是中医治疗中风的经典方剂，以益气活血为组方原则。有研究也表明，补阳还五汤联合骨髓基质干细胞移植可以明显改善缺血再灌注大鼠的脑梗死面积，神经功能缺损［10-11］。本研究表明补阳还五汤干预骨髓MSCs移植，能够促进神经元的再生，修复损伤的神经，进一步改善神经功能的恢复。其机理可能与上调GAP-43基因表达有关。

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