逍遥散对阿尔茨海默病大鼠海马CA3区PP-2A、GSK-3β表达的影响①

赵唯贤 李高申 王保伟 李宜培 刘建涛 郭梅珍 刘俊玲(河南医学高等专科学校，郑州451191)

·中医中药与免疫·

逍遥散对阿尔茨海默病大鼠海马CA3区PP-2A、GSK-3β表达的影响①

赵唯贤 李高申②王保伟 李宜培 刘建涛 郭梅珍②刘俊玲③(河南医学高等专科学校，郑州451191)

目的:探讨逍遥散对阿尔茨海默病大鼠海马CA3区PP-2A、GSK-3β表达的影响。方法:将清洁级大鼠随机分为4组，其中模型组、西药组、中药组均采用D-gal腹腔注射和A-β 1～42 peptide双侧海马注射联合造模，生理组仅采用等体积灭菌生理盐水腹腔及海马注射造模。造模完成后，生理组、模型组均用生理盐水灌胃，西药组和中药组分别用奥拉西坦溶液和逍遥散煎剂灌胃，四组灌胃体积均为5 ml/kg，每日1次，连续28 d。灌胃结束后即分离鼠脑，分组标记放入4℃ 4%戊二醛固定液玻璃容器密封，4℃保存。修块，切取海马区组织，石蜡包埋，切片。PP-2A稀释度为1∶200，GSK-3β稀释度为1∶150。图像采用Image-pro Plus 5.0分析系统分析，数据采用SPSS11.5统计软件分析，4组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。结果:PP-2A阳性细胞数、平均光密度及阳性面积、积分光密度等指标的表达，在逍遥散灌胃干预后与模型组比较明显增加(P＜0.01);GSK-3β以上各项指标在经逍遥散灌胃后较模型组明显减少(P＜0.01)。结论:逍遥散可以上调PP-2A表达和下调GSK-3β表达，可能对凝聚态A-β 1～42 peptide诱导的海马Tau蛋白过度磷酸化有一定的抑制作用。

逍遥散;阿尔茨海默病;海马CA3区;蛋白磷酸酶-2A;糖原合成酶激酶-3β

阿尔茨海默病(Alzheimer′s diseas，AD)即老年性痴呆，是以进行性认知障碍及记忆能力损害为主的中枢神经系统退行性病变。海马CA3区是学习记忆的关键脑区[1]，也是易受衰老影响的脑区之一。本课题以SD大鼠腹腔注射D-半乳糖(D-gal)和海马注射A-β 1～42 peptide，建立AD大鼠模型，通过逍遥散干预治疗，检测蛋白磷酸酶-2A(PP-2A)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)在海马 CA3区表达的变化，进一步探讨中药疏肝方剂对AD病的治疗意义。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级SD雄性大鼠，由河南省实验动物中心提供，批号:SCXX(豫)2010-0002)，鼠龄4～5个月，体重(250±20)g。

1.2 药品 逍遥散煎剂，组成:柴胡、当归、白芍、茯苓、炙甘草、生姜、薄荷，按10∶10∶10∶10∶5∶1∶1 比例配比;方法:由本课题组严格按中药煎剂制备流程制作，于每日用药前2 h即时配备，最后经水浴箱蒸发浓缩至含生药2 g/ml的药液浓度，晾至常温备用。奥拉西坦溶液(奥拉西坦胶囊，石药集团欧意药业有限公司提供，400 mg/粒，批号:05110703)，于每日用药前30 min，用常温蒸馏水将奥拉西坦药粉稀释成150 mg/ml的浓度，备用。

1.3 试剂 A-β 1～42 peptide(北京博奥森生物技术有限公司提供，批号:990901);D-半乳糖(D-gal，Genview公司，北京鼎国昌盛生物技术有限公司分装，批号:22L10133);PP2A-antibody(abgent，编号AJ1644a);GSK-3βantibody(CST，编号 9315s);冷冻包埋剂McCormick(USA)。

1.4 仪器 Morris水迷宫系统(DMS2，中国医学科学院药物研究所);蓝星B型脑立体定位仪(安徽淮北正华生物仪器设备有限公司产);洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);Image-pro Plus 5.0图像分析系统。

1.5 方法

1.5.1 动物分组 大鼠适应性喂养3 d[光照节律12L:12D(6:00～18:00)，室温 22℃ ～24℃，湿度30% ～40%]，食用普通鼠用颗粒饲料(河南省实验动物中心提供)，自由饮水。根据水迷宫实验数据，留用成绩最优者作为正式实验用鼠，随机分为生理组、模型组、西药组、中药组。

1.5.2 造模方法 模型组、西药组、中药组均采用D-gal腹腔注射和A-β 1～42 peptide双侧海马注射联合造模[2]。方法:①D-gal:自造模第1天始，每天上午9∶00 ～10∶00，按10 ml/kg(浓度:10 mg/ml)剂量，大鼠左下腹腹腔注射，连续42 d;②A-β:在D-gal造模结束当日，大鼠用10%水合氯醛，4 ml/kg，腹腔注射麻醉，脑立体定位仪固定，将大鼠头部毛发剪短，常规消毒，正中矢状切开皮肤，暴露头骨，以前囟为基准点后移4 mm，左右各移2 mm处确定左右侧海马位置，牙科钻开颅，暴露硬脑膜，将孵育好的A-β生理盐水溶液(浓度:5 μg/μl)，用微量注射器每侧海马缓慢注入2 μl，骨蜡封闭针孔，缝皮，消毒，腹腔注射20×104U青霉素以防感染。生理组如前方法仅采用等体积灭菌生理盐水腹腔及海马注射象征性处理。

1.5.3 给药方法 以上造模结束后的第4天，每天上午9∶00对各组大鼠进行灌胃给药，5 ml/kg，每日1次，连续28 d。其中生理组、模型组均用生理盐水灌胃，西药组和中药组分别用奥拉西坦溶液和逍遥散煎剂灌胃。

1.5.4 取材 灌胃结束后第4天，大鼠经10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉，断头处死，在滴有4℃的4%戊二醛固定液的蜡板上(蜡板放置于冰盒上)，迅速分离鼠脑，分组标记放入4℃ 4%戊二醛固定液玻璃容器密封，4℃保存。

1.5.5 免疫组织化学染色程序 鼠脑修块，切取海马区组织，石蜡包埋，进行切片，各组样本海马CA3区冠状切片层面保持一致。切片4℃保存。切片室温放置，在0.5%TritonX-100溶液中37℃孵育10 min，用0.05 mol/L TBS漂洗，3%的H2O2溶液室温浸泡15 min，10%的正常羊血清原液封闭(用0.5% TritonX-100溶液稀释)室温轻摇1 h，吸掉封闭血清，加入用5%羊血清和0.5%TritonX-100混合液稀释的一抗(PP2A稀释度为1∶200，GSK-3β稀释度为1∶150)，室温孵育3 h。加入生物素标记的二抗(用5%羊血清和0.5%TritonX-100混合液稀释，稀释度为1∶500)，室温孵育1 h;加入配好的ABC反应液(1∶100)，室温孵育2 h。

1.5.6 图像处理 选取每批每组冠状切面相似的切片进行照相。图像在Image-pro Plus 5.0分析系统分析。每个图像选取200 μm×200 μm进行阳性细胞计数测试;同时测量各分区任意面积的积分光密度和阳性物面积(μm2)。用光密度表示各蛋白的相对含量。

1.6 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件进行数据分析，4组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

蛋白磷酸酶-2A(PP-2A)阳性细胞数、平均光密度及阳性面积、积分光密度等表达的各项指标在生理组中较多，在模型组中明显减少，2组比较P＜0.01;而经逍遥散灌胃干预后西药组较模型组比较阳性细胞数、平均光密度及阳性面积、积分光密度明显增加，分别为P＜0.01和P＜0.05;灌胃后的中药组PP-2A阳性细胞数、平均光密度及阳性面积、积分光密度等各项指标与模型组比较也明显增加(P ＜0.01)，见表1、图1。

糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)以上各项指标在生理组中较少，在模型组中的表达呈增多趋势，2组比较P＜0.01;经逍遥散灌胃后西药组和中药组GSK-3β各项指标均出现了减少(P＜0.01)。见表2和图2。

表1 PP-2A在海马CA3区表达的变化(±s)Tab.1 Expression changes of PP-2A in hippocampal CA3( ± s)

表1 PP-2A在海马CA3区表达的变化(±s)Tab.1 Expression changes of PP-2A in hippocampal CA3( ± s)

Note:Compared with physiological group，1)P ＜0.01;compared with model group，2)P ＜0.01，3)P ＜0.05.

Groups n Positive cell number Positive area(μm2) Average light density (MOD) Integrated optical density (IOD，×103) 054 4 0.343 2 ±0.041 7 45.03 ±7.95 Model group 10 66.61 ±3.081) 0.402 3 ±0.036 01) 0.253 8 ±0.024 71) 33.56 ±6.771) Western medicine group 10 75.25 ±4.062) 0.460 9 ±0.055 33) 0.315 3 ±0.031 52) 42.84 ±8.403) Chinese medicine group 10 78.04 ±3.132) 0.496 6 ±0.066 22) 0.324 6 ±0.030 12) 41.92 ±8.353) Physiological group 10 77.71 ±3.33 0.509 0 ±0.

图1 大鼠CA3区PP2A各组的表达Fig.1 Expression of each PP2A group in rat CA3 region

表2 GSK-3β在海马CA3表达的变化(±s)Tab.2 Expression changes of GSK-3β in hippocampal CA3( ± s)

表2 GSK-3β在海马CA3表达的变化(±s)Tab.2 Expression changes of GSK-3β in hippocampal CA3( ± s)

Note:Compared with physiological group，1)P ＜0.01;compared with model group，2)P ＜0.01.

Groups n Positive cell number Positive area(μm2) Average light density(MOD) Integrated optical density (IOD，×103) 017 2 0.178 6 ±0.034 0 8.66 ±0.80 Model group 10 108.49 ±7.651) 0.399 6 ±0.048 21) 0.253 8 ±0.024 71) 10.94 ±0.861) Western medicine group 10 95.09 ±7.002) 0.325 9 ±0.034 12) 0.207 5 ±0.042 12) 9.94 ±0.812) Chinese medicine group 10 96.22 ±10.402) 0.297 4 ±0.035 92) 0.193 8 ±0.027 42) 9.38 ±0.762) Physiological group 10 88.46 ±6.96 0.254 6 ±0.

图2 大鼠CA3区GSK-3β各组的表达Fig.2 Expression of each GSK-3β group in rat CA3 region

3 讨论

海马是学习与记忆的重要结构之一。学习记忆的结构基础是大脑边缘系统，特别是海马CA3区，是形成空间辨别性学习记忆过程的重要结构，海马CA3区神经元是参与学习记忆功能的重要细胞[3]。

Tau蛋白过度磷酸化是AD的主要分子生化改变之一。参与调节Tau蛋白磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶有多种，但其中GSK-3β和PP-2A是较为关键的两种蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶。经凝聚态Aβ处理的大鼠GSK-3β的总量和其活性形式——磷酸化 GSK-3β[pTyr279，216]的表达增加[4]，显示凝聚态A-β通过激活GSK-3来诱导Tau蛋白的过度磷酸化。Tau蛋白异常磷酸化，则神经元凋亡和轴突转运障碍。AD脑中Tau蛋白的异常过度磷酸化与蛋白激酶(如GSK-3β)和蛋白磷酸酯酶(如PP-2A)这两种酶的调节失衡有关。蛋白激酶活性的增强或蛋白磷酸酯酶活性的减弱均可使Tau蛋白出现过度磷酸化。而使过度磷酸化的Tau蛋白去磷酸化成为逆转AD分子生化改变的关键[4]。PP-2A是促使Tau蛋白去磷酸化的重要酯酶。磷酸酯酶活性降低，尤其是PP-2A活性降低，在Tau蛋白的异常过度磷酸化中起关键性作用[5]。

GSK-3β的活性受丝氨酸和酪氨酸磷酸化的调节，酪氨酸Tyr216位点是GSK-3β活化的关键位点，该位点磷酸化可使GSK-3β的活性增加;而丝氨酸Ser9位点的磷酸化则下调GSK-3β的活性[4]。

神经元内神经原纤维缠结是AD的重要病理学特征[6]，神经原纤维缠结的主要成分是异常过度磷酸化的微管相关蛋白Tau，而老年斑的主要成分是β淀粉样多肽(A-β)。GSK-3β可致使大鼠海马神经元内可溶性Aβ前体蛋白沉积而形成老年斑[7]。

逍遥散出自宋《太平惠民和剂局方》，为疏肝解郁、健脾养血的重要方剂。作为调治情志的经典方剂，在精神科应用所涉及到的疾病(症)种类非常之多，有研究显示包括了隐匿性抑郁症、忧郁症、恐畏、癔症、神经官能症、精神分裂症等精神系统疾病就有13种。现代药理研究认为逍遥散具有调节中枢单胺类神经递质、调整体内激素水平、调节免疫、保肝、抗自由基和改善微循环等药理作用[8]。就AD的临床表现看，早期常出现典型的抑郁症状和对日常活动的兴趣丧失、记忆力减退、智力下降、性格改变等，因此，中医将AD归属于“呆病”、“郁证”等门类。当今老龄化社会中，由于老人丧偶独身居住、子女不孝等因素普遍存在，使老龄孤独寂寞，加重了情绪压抑，促成了情志的失调、肝失疏泄。气郁则血行不畅;肝血不足则肾精失充、髓海失养、神魂不藏。

研究显示:逍遥散治疗的大鼠海马突触的CA3区数密度与面密度较病理组均有明显升高，说明逍遥散能抑制应激对大鼠海马突触体的损害;而与病理组比较，逍遥散治疗后的大鼠海马突触连接带的平均面积显著减小，进一步说明逍遥散有抗大鼠海马突触体应激损伤的作用[9]。

本实验研究结果显示:经逍遥散灌胃后PP-2A阳性细胞数、平均光密度及阳性面积、积分光密度等各项指标的表达与模型组比较均明显增加(P＜0.01);GSK-3β以上各项指标在逍遥散灌胃后均出现了减少(P＜0.01)。进而可初步认为逍遥散能上调大鼠海马CA3区PP-2A表达和下调GSK-3β表达，可能对凝聚态A-β1-42肽诱导的海马Tau蛋白过度磷酸化有一定的抑制作用。

[1]林逢春，闫 也.阿尔茨海默病发病机制研究的现状与进展[J].辽宁医学院学报，2009，30(6):558-560.

[2]李 林，茹立强.D-半乳糖-Aβ复合造模致大鼠学习记忆功能障碍及丹参酮治疗作用的研究[J].江西医学院学报，2009，49 (1):13.

[3]马志健，牛海艳，易西南，等.血管性痴呆模型大鼠海马CA3区微管相关蛋白-2的表达及其意义[J].现代生物医学进展，2009，9(12):2231-2233，封 2.

[4]曾育琦，陈晓春，黄 春，等.人参皂苷Rg1通过调节PP-2A/ GSK-3β活性减轻皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化[J].解剖学报，2007，38(6):665-670.

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[收稿2013-12-25 修回2014-01-02]

(编辑 许四平)

Effect of Xiaoyao Powder on Alzheimer's disease in hippocampal CA3 region of rats PP-2A，GSK-3β expression

ZHAO Wei-Xian，LI Gao-Shen，WANG Bao-Wei，LI Yi-Pei，LIU Jian-Tao，GUO Mei-Zhen，LIU Jun-Ling.Henan Medical College，Zhengzhou 451191，China

Objective:To study the effect of Xiaoyao Powder on Alzheimer′s disease in hippocampal CA3β region of rats PP-2A，GSK-3β expression.MethodsRats were randomly divided into four groups，including model group，western medicine group，Chinese medicine group were treated with intraperitoneal injection of D-gal and A-β 1-42 peptide bilateral hippocampal injection molding，physiological group only with equal volume of sterile saline intraperitoneal and hippocampal injection molding.The model was completed，normal group，model group were perfused with saline，western medicine group and Chinese medicine group were treated with oxiracetam solution and Xiaoyao decoction，four groups of intragastric volume was 0.5 ml/100 g，1 time a day，continuous 28 d.After intragastric administration of isolated rat brain immediately，packet marking in 4℃ 4%glutaraldehyde solution of glass container，stored at 4℃.Repair piece，cut from the hippocampus，embedded in paraffin，sliced.Dilution of PP-2A for 1∶200，GSK-3β dilution of 1∶150.Images were analyzed by using Image-pro Plus 5 image analysis system，data were conducted by SPSS11.5 statistical analysis software，the comparison between 4 groups by single factor analysis of variance，between the two two groups was compared by LSD-t test，the test level of α =0.05.ResultsThe expression of PP-2A positive cell number and the positive area，average optical density，integral optical density index，in Xiaoyao Powder orally intervention compared with the model group increased significantly (P ＜0.01);GSK-3β above indices were significantly decreased than that in model group after Xiaoyao Powder after intragastric administration(P ＜0.01).ConclusionXiaoyao Powder can up regulate the expression of PP-2A and down regulate expression of GSK-3β，may be condensed A-β 1-42 peptide induced hyperphosphorylation of Tau has certain inhibition.

Xiaoyao Powder;Alzheimer disease;Hippocampus CA3;Protein phosphatase-2A;Glycogen synthase kinase-3 beta

R285.5

A

1000-484X(2014)05-0623-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.011

①本文为河南省2012年度科技计划项目(122102310410)和河南省教育厅青年骨干教师资助项目(2011GGJS-220)。②通讯作者，黄河科技学院，郑州450006。

③郑州市职业病防治所，郑州450053。

赵唯贤(1963年-)，男，副教授，主要从事中医教学及老年医学研究工作。