rIL-10基因干预对肝纤维化大鼠肝组织中胶原、MMP13及TIMP1表达的影响①

黄月红 陈运新 张莉娟 陈治新 王小众 (福建医科大学附属协和医院消化内科，福州350001)

rIL-10基因干预对肝纤维化大鼠肝组织中胶原、MMP13及TIMP1表达的影响①

黄月红 陈运新 张莉娟 陈治新 王小众②(福建医科大学附属协和医院消化内科，福州350001)

目的:观察胶原、基质金属蛋白酶13(Matrix metalloproteinase 13，MMP13)及其抑制物基质金属蛋白酶抑制物-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1)在猪血清诱导的肝纤维化大鼠肝组织中的表达及大鼠白介素10(rat interleukin-10，rIL-10)基因干预的影响，探讨rIL-10基因抗肝纤维化的作用机制。方法:30只清洁级SD大鼠随机分为正常对照组(C组)和纤维化模型组。C组每周腹腔注射2次生理盐水，每次0.5 ml，共8周;纤维化模型组每周腹腔注射2次猪血清，每次0.5 ml，共8周。至造模第5周开始模型组随机分为纤维化组(M组)，rIL-10基因干预组(I组)及空质粒对照组(P组)。C组和M组大鼠尾静脉注射林格氏液作为试剂对照，I组大鼠尾静脉注射rIL-10质粒pcDNA3-rIL-10，P组大鼠尾静脉注射pcDNA3空质粒，每周1次。于第8周末处死所有大鼠。天狼猩红染色检测各实验组大鼠肝组织胶原沉积情况，S-P免疫组化检测各组大鼠肝脏MMP13及TIMP1表达的情况。结果:天狼猩红染色显示:与C组比较，猪血清诱导的肝纤维化模型M组及空质粒对照P组大鼠肝组织中胶原沉积面积显著增多(P＜0.01);与M组和P组比较，rIL-10基因干预I组大鼠肝组织中胶原的沉积面积显著减少(P＜0.01);免疫组织化学染色结果显示:与C组比较，猪血清诱导的肝纤维化模型M组及空质粒对照P组大鼠肝组织中MMP13及TIMP1表达明显增强(P＜0.01)，I组纤维化大鼠肝组织中MMP13表达上调而TIMP1表达显著减少(P＜0.01)，与M组和P组比较，I组纤维化大鼠肝组织中MMP13及TIMP1表达显著减少(P＜0.01)。结论:rIL-10基因抑制肝纤维化大鼠肝脏胶原沉积与其抑制基质金属蛋白酶抑制物TIMP1的表达相关。

肝纤维化;大鼠白介素10;基因治疗;基质金属蛋白酶-13;基质金属蛋白酶抑制物-1

肝纤维化是肝脏对各种慢性损伤的修复反应，其本质是肝组织合成增加和(或)降解减少所致各种胶原及非胶原糖蛋白等细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)过度沉积，是肝硬化的早期病理改变。肝硬化是消化系统常见病，其严重的并发症及高病死率是临床治疗的难点。目前研究认为肝纤维化是一个动态、双向的过程，阻止或延长肝纤维化的形成是肝硬化研究的热点。白介素10(Interleukin 10，IL-10)是一类具有多种生物学活性的免疫抑制性细胞因子，前期研究表明外源性细胞因子IL-10具有一定的拮抗肝纤维化形成的特性[1]，但其具体的作用机制仍未阐明。本实验拟通过猪血清诱导免疫型大鼠肝纤维化并行rIL-10基因干预，观察rIL-10基因干预对肝纤维化大鼠肝组织中胶原沉积、基质金属蛋白酶-13(Matrix metalloproteinase 13，MMP13)、基质金属蛋白酶抑制物-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1)表达的影响，进一步探讨rIL-10抗肝纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 大鼠 雄性清洁级 SD大鼠30只，体重200～300 g，中国科学院上海实验动物中心[许可证号SCXK(沪)2003-0003]，清洁级条件喂养，自由进食进水。动物实验遵照福建医科大学伦理委员会实验动物管理条例执行，并接受伦理委员会的监督和指导。

1.1.2 实验试剂 pcDNA3-rIL-10真核表达质粒由本实验室构建;pcDNA3空质粒本实验室保存;Qiagen Maxi-Prep质粒大抽提试剂盒购自美国Qiagen公司、猪血清购自芬兰PAA细胞培养公司、超敏二步法免疫组化检测试剂及浓缩型DAB显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司;大鼠MMP13及TIMP1单克隆抗体购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 质粒的提取 通过碱裂解法原理提取pcDNA3空质粒与pcDNA3-rIL-10真核表达质粒，操作步骤严格按Qiagen质粒大抽提试剂盒说明书进行。

1.2.2 质粒DNA尾静脉快速大容量注射[2]rIL-10基因通过质粒DNA尾静脉快速大容量注射靶向转移至大鼠的肝组织[3]。清洁级雄性SD大鼠在10%水合氯醛(0.3 ml/100 g体重)麻醉下，24G静脉套管针尾静脉注射大鼠体重8%林格氏溶液(内含pcDNA3-rIL-10真核表达质粒或空质粒)，rIL-10基因浓度为1 μg/g体重，注射时间控制在10 s以内。

1.2.3 大鼠肝纤维化模型建立及实验分组 造模及实验分组:30只体重100～120 g、清洁级、雄性SD大鼠按随机数字表分为正常对照组(C组，6只)和纤维化模型组(24只)。肝纤维化模型组大鼠腹腔内注射猪血清，正常对照组大鼠腹腔注射生理盐水每周2次，每次0.5 ml，共8周。至肝纤维化造模第5周，模型组被随机分为纤维化组(M组，8只)，rIL-10基因干预组(I组，8只)，空质粒对照组(P组，8只)。C组和M组大鼠尾静脉注射林格氏液作为试剂对照，I组大鼠尾静脉注射pcDNA3-rIL-10质粒，P组大鼠尾静脉注射 pcDNA3空质粒，每周1次，共4周。

1.2.4 肝组织标本收集 于第8周末处死所有实验大鼠，收集各组大鼠肝组织。用10%甲醛固定后石蜡包埋、切片以备后续实验。

1.2.5 天狼猩红染色法检测肝组织中胶原表达

各组大鼠肝组织石蜡切片常规脱蜡至水，入天青石蓝液10 min，蒸馏水洗3次，苦味酸天狼猩红染色30 min，纯酒精分化2 s，脱水、透明，中性树胶封片。胶原纤维表达的图像分析:BX-41奥林巴斯显微呈像系统，对阳性染色区域进行图像半定量分析。每张切片随机选5个不同视野，以5个不同视野面积百分比的平均值为每张切片半定量数值。

1.2.6 免疫组织化学法检测大鼠肝组织MMP13与TIMP1的表达 采用超敏S-P免疫组织化学染色，具体操作按北京中杉金桥生物技术有限公司SP试剂盒说明进行。切片脱蜡、水化，枸橼酸盐微波或胰蛋白酶抗原修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，一抗分别为，兔抗大鼠MMP-13多抗(1∶100)，兔抗大鼠TIMP-1多抗(1∶200)，二抗，DAB显色，苏木素复染。省略一抗和二抗作为空白对照;以PBS替换一抗，作为阴性对照。阳性染色者在细胞浆或/和核或/和膜有棕黄色颗粒沉着。染色结果根据染色细胞多少及染色深浅判断各指标表达情况，使用Im-age-pro plus 5.0软件检测各组目的蛋白表达综合光密度(IOD)。

2 结果

2.1 rIL-10基因干预减少纤维化大鼠肝脏组织中胶原的沉积[3]天狼猩红染色是判断肝组织胶原沉积的经典方法[4]。肝组织中胶原组织呈红色，非胶原组织呈黄色。染色结果显示(图1A):C组大鼠肝小叶结构正常，中央静脉壁周围及肝窦周围有少量胶原纤维着色，M组大鼠肝脏组织中可见大量胶原沉积，形成纤维间隔并向肝组织穿插形成大小不等的假小叶;P组大鼠胶原沉积的情况与M组相似。I组肝组织胶原沉积明显减少，无纤维间隔。通过图像半定量分析结果显示(图1B):与C组比较，M组、P组胶原纤维含量显著增高(P＜0.01);与M组和P组比较，I组胶原纤维含量显著下降(P＜0.01);P组与M组之间胶原纤维沉积没有显著的改变(P ＞0.05)。

图1 各实验组肝组织胶原纤维沉积情况(天狼猩红染色，×200)Fig.1 Deposition of collagen in liver of different groups (Sirius Red staing，×200)

图2 各实验组肝组织MMP13的表达情况(免疫组织化学染色，×200)Fig.2 Expression of MMP13 in liver of different groups (Immunohistochemistry staining，×200)

图3 各实验组肝组织TIMP1的表达情况(免疫组织化学染色，×200)Fig.3 Expression of TIMP1 in liver of different groups(Immunohistochemistry staining，×200)

2.2 rIL-10基因干预抑制纤维化大鼠肝脏组织MMP-13的表达 免疫组化结果显示(图2A): MMP-13棕黄色阳性着色主要位于肝细胞及窦周细胞的胞浆。MMP-13蛋白阳性表达半定量分析结果显示(图2B)，与C组比较，M组、P组及I组的大鼠肝组织中MMP13表达明显增强，差别具有统计学意义(P＜0.01)，与M组和P组比较，I组纤维化大鼠肝组织中MMP13表达显著减少，差别具有统计学意义(P ＜0.01)。

2.3 rIL-10基因干预抑制纤维化大鼠肝脏组织中TIMP-1的表达 免疫组化结果显示:TIMP-1棕黄色阳性着色主要位于肝窦周围细胞及胶原纤维沉积的部位(图3A)。TIMP-1阳性表达半定量分析结果显示(图3B)，与C组比较，P组与M组大鼠的肝组织中TIMP-1表达明显增强，差别具有统计学意义(P＜0.01)，I组大鼠的肝组织TIMP-1阳性着色显著降低，差别具有统计学意义(P＜0.01);与P组与M组比较，I组大鼠的肝组织TIMP-1阳性着色范围及程度均显著降低，差别具有统计学意义(P＜0.01)。

3 讨论

肝纤维化主要病理改变是以胶原为主的细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的合成与降解失平衡，是各种损伤导致的慢性肝脏疾病的共同病理改变，是肝硬化的早期病理改变。肝纤维化时肝组织内ECM的降解主要依赖一类具有Ca2+-Zn2+离子依赖的内源性基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)及其抑制因子基质金属蛋白酶组织抑制因 子 (Tissue inhibitorofmetalloproteinases，TIMPs)的调节。因此任何提高MMPs、降低TIMPs的表达与活性，促进ECM降解的方法都有可能成为抗肝纤维化的有效手段。

IL-10是一类主要Th2细胞产生的具有多种生物学功能的细胞因子[5]，研究显示IL-10与肝纤维化的发生发展密切相关[6]。研究发现在肝纤维化早期肝星状细胞(HSC)表达IL-10，而在肝纤维化后期IL-10表达下降至消失，及IL-10基因缺陷的小鼠较野生型小鼠更易形成肝纤维化等研究结果提示肝纤维化时肝脏内IL-10的表达缺失与肝纤维化的进展密切相关[7，8]。前期实验证实外源性 IL-10可拮抗CCL4诱导的大鼠肝纤维化的作用及肝脏靶向表达rIL-10基因能拮抗猪血清诱导的大鼠肝纤维化的形成[1，3，9]。猪血清诱导的大鼠肝纤维化是一种由异种血清引起的免疫性肝纤维化动物模型，其特点是肝细胞损伤较轻而免疫反应强烈。此种免疫反应是由MHCⅡ类分子及炎性细胞调节，活化肝星状细胞，活化的肝星状细胞分泌 ECM形成肝纤维化[10，11]。本实验天狼猩红染色结果显示猪血清造模结束时肝纤维化大鼠肝组织中可见大量以胶原为主的ECM沉积，形成宽大的纤维束向肝组织穿插形成大小不等的假小叶。行rIL-10基因干预4周后，纤维化大鼠肝组织中ECM明显减少，仅见少量、不连续的、细薄的胶原纤维沉积。提示rIL-10基因干预能减少ECM的沉积，具有拮抗肝纤维化形成的作用，但其抗纤维化机制是否通过改变 MMPs与TIMPs的表达有关，仍不清楚。

目前已发现的MMPs主要分为四大类:①胶原酶，MMP1、MMP8、MMP13，主要是降解Ⅰ、Ⅲ型间质胶原，但MMP13是大鼠体内主要降解Ⅰ、Ⅲ型胶原的间质胶原酶。②明胶酶，MMP2和MMP9，主要降解Ⅳ型胶原及变性胶原，在纤维化形成早期起主要作用。③基质分解素，如MMP3、MMP7等主要降解蛋白多糖，层粘蛋白等。④膜型MMPs，有MMP14、MMP15等即可降解胶原也能激活其他 MMPs[12]。TIMPs主要与特定的活性胶原酶MMPs通过非共价键结合成1∶1复合物，抑制后者对ECM的降解。多项研究表明上调基质金属蛋白酶MMP13及抑制基质金属蛋白酶抑制物TIMP1的表达可增加ECM的降解从而减轻大鼠肝纤维化[13，14]。但 rIL-10 基因抑制纤维化大鼠肝组织中胶原的沉积是否与MMP13和TIMP1的表达相关呢?国内外研究显示MMP13的表达在不同的肝纤维化模型大鼠中表达不尽相同，Yan等[15]用RT-PCR法连续观察了酒精诱导的大鼠肝纤维化形成过程MMP13的表达模式，结果发现在肝纤维化形成早期(第4周)MMP13表达开始上调，12周时表达达到高峰，24周后表达下降，提示MMP13主要参与了大鼠肝纤维化的早期新形成基质的降解;而在胆汁淤积性纤维化大鼠中MMP13表达下调[14]。前期研究证实TIMP1随着肝脏纤维程度增强表达水平逐渐升高[16]。本实验结果显示猪血清诱导肝纤维化大鼠肝组织中肝实质与非实质细胞均可见MMP13阳性表达，提示肝纤维化时大量的胶原沉积反馈激活肝实质与非实质细胞表达MMP13增高加强沉积胶原的降解作用;而TIMP1阳性表达主要见于胶原沉积的部位，提示TIMP1的表达部位与胶原沉积部位密切相关，与肝纤维化时活化的肝星状细胞是肝组织中TIMP1的主要来源细胞[17]结果相符。半定量结果显示肝纤维化大鼠MMP13与TIMP1的阳性表达较正常对照组大鼠明显增多，推测肝纤维化形成时高表达的TIMP1明显可能抑制了MMP13的活性，从而减弱其降解胶原的能力导致ECM沉积增多。但rIL-10基因干预后以胶原沉积为主的ECM沉积减少是否是通过增强MMP13及抑制TIMP1的表达而实现的呢?免疫组化结果显示rIL-10基因干预四周后的肝纤维化大鼠伴随着胶原沉积面积的下降MMP13与TIMP1的表达也明显下调，提示rIL-10基因干预能下调MMP13与TIMP1的表达。但rIL-10基因干预后纤维化大鼠肝组织中MMP13和TIMP1下降程度是不同的，大鼠肝组织中TIMP1下降程度较MMP13明显，提示rIL-10基因干预减轻肝组织胶原沉积可能主要通过抑制肝组织中TIMP1的表达而实现，但具体机制仍有待体外实验进一步证实。

综上所述，MMP13与TIMP1在猪血清诱导的肝纤维化大鼠肝组织表达情况与胶原沉积面积密切相关，rIL-10基因干预可通过抑制TIMP1的表达从而促进沉积胶原的降解。

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[收稿2013-11-20 修回2013-12-26]

(编辑 倪 鹏)

Effects of rat interleukin-10 gene treatment on expression of collagen，MMP13 and TIMP1 in fibrotic rats

HUANG Yue-Hong，CHEN Yun-Xin，ZHANG Li-Juan，CHEN Zhi-Xin，WANG Xiao-Zhong.Department of Gastroenterology，Fujian Medical University Union Hospital，Fuzhou 350001，China

Objective:To study the effects of rat interleukin-10(rIL-10)gene treatment on the expression of collagen，matrix metalloproteinase 13(MMP13)and their specific inhibitors the tissue inhibitor of metalloproteinase 1(TIMP1)in porcine serum induced liver fibrosis rats then to explore the anti-fibrotic effect of rL-10.MethodsThirty SD rats were divided into normal control and fibrosis model group.Normal control group(group C)was intraperitoneally injected with 0.5 ml normal sodium twice a week for 8 week，while the fibrosis model group was injected with equal volume of pig serum for 8 week.At the beginning of the 5thweek，fibrosis model group was further randomly divided into a fibrosis model subgroup(group M)，rIL-10 gene treatment subgroup(group I)and empty vector control subgroup(group P).Rats in group C and M were injected with Ringer’s solution as a reagent control via the tail vein weekly，rats in group I were injected with the rIL-10 plasmid pcDNA3-rIL-10，and rats in group P were injected with empty vector pcDNA3.All rats were sacrificed at the end of 8thweek，and the liver tissue samples were collected to observe deposition of collegan in liver tissue by sirius red staining and detected the expression of MMP13 and TIMP1 in the liver tissue by SP immunohistochemistry.ResultsSirius red staining showed that the area of the collegan deposition was dramatically increased in fibrosis model subgroup and empty vector control subgroup compared with the normal control group，and the area of the collagen deposition was dramatically decreased in rIL-10 gene treatment subgroup compared with the fibrosis model and empty vector control subgroup.Immunohistochemistry analysis showed that the expression of MMP13 and TIMP1 in fibrosis model subgroup and empty vector control subgroup was significantly higher than the normal control group，but compared with normal control group，expression of MMP13 was significantly increased and expres-sion of TIMP1 was significantly decreased in rIL-10 gene treatment subgroup.Compared with fibrosis model subgroup and empty vector control subgroup，the expression of MMP13 and TIMP1 was dramatically decreased in rIL-10 gene treatment subgroup.ConclusionrIL-10 gene treatment attenuates the area of collagen deposition in liver fibrosis rats associated with downregulation of TIMP1.

Liver fibrosis;Rat interleukin 10;Gene therapy;Matrix metalloproteinase 13;Tissue inhibitor of metalloproteinase 1

Q786 R392.11

A

1000-484X(2014)05-0613-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.009

①本文为福建省科自然基金资助项目(2010J05062)、福建卫生厅青年科研项目(2010-1-10)和福建省临床医学重点专科资助项目(闽卫科教[2012]149号)。

②通讯作者，E-mail:drwangxz@163.com。

黄月红(1976年－)，女，博士，副主任检验师，主要从事肝纤维化分子发生机制及IL-10的抗纤维研究，E-mail:2003huangyh@ sina.com。