亚低温对大鼠脑损伤后TNF-α、IL-1β及NF-κB表达的影响

王亚楠 张 勇 王 宁 刘鑫颖 (唐山市工人医院检验科，唐山063000)

亚低温对大鼠脑损伤后TNF-α、IL-1β及NF-κB表达的影响

王亚楠①张 勇②王 宁 刘鑫颖 (唐山市工人医院检验科，唐山063000)

目的:观察亚低温治疗对创伤性脑损伤大鼠脑组织肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)及核转录因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)表达的影响，探讨亚低温的脑保护作用及可能机制。方法:将45只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)，脑损伤组(TBI组)，亚低温治疗组。采用Marmarou’s法建立创伤性脑损伤大鼠模型，损伤后立即开始诱导亚低温，持续3 h，于伤后1 d、3 d、5 d分别处死各组大鼠留取脑组织。采用干湿重法测量脑组织含水量，免疫组织化学法及Western blot法检测各组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β及NF-κB的蛋白表达情况。结果:与Sham组相比，TBI组大鼠脑组织含水量升高(P＜0.05)，3 d达水肿高峰，TNF-α、IL-1β和 NF-κB的表达显著增加(P＜0.05)，均为1 d达高峰，持续高表达至5 d;与TBI组相比，亚低温治疗组大鼠各时间点脑组织含水量降低(P＜0.05)，TNF-α、IL-1β和NF-κB的表达明显减少(P＜0.05)。结论:高表达的TNF-α、IL-1β和NF-κB参与了TBI的病理过程。亚低温治疗可通过下调NF-κB信号分子，减轻创伤性脑损伤后脑组织的炎性反应，缓解脑水肿，进而起到脑保护作用。

亚低温;创伤性脑损伤;脑水肿;大鼠

创伤性脑损伤(Traumatic brain injury，TBI)是神经系统常见疾病，占全身各部位损伤的第二位，死亡率居第1位，有较高的致残率和致死高，严重影响人类的健康[1]。随着对脑损伤发病机制的深入研究，细胞因子在继发性脑损伤中发挥的作用开始备受关注。其中 TNF-α、IL-1β 及 NF-κB 在 TBI诱导的炎症反应中起核心作用[2]。近几年来，颅脑外伤的亚低温治疗开始被国内外学者所重视。亚低温可缓解脑组织继发性损伤，促进神经功能的恢复，具有明显的脑保护作用[3]。尽管亚低温在TBI的实验研究和临床治疗中都取得了一定的成效，但其具体作用机制尚有待进一步研究。然而，亚低温治疗对TBI后大鼠脑组织 TNF-α、IL-1β及NF-κB 表达影响的报道少见。本实验拟利用Marmarou’s法建立大鼠TBI模型，通过免疫组化与免疫印迹方法检测TNF-α、IL-1β 及 NF-κB 的蛋白表达情况，并进行细胞因子表达的相关性分析，验证亚低温通过抑制NF-κB活化，下调炎性因子TNF-α和IL-1β的表达，阻断炎症级联反应，减轻或避免继发性炎症反应引起的脑水肿，最终达到脑保护作用。以期为亚低温治疗脑损伤的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 兔抗大鼠 TNF-α、IL-1β及 NF-κB多克隆抗体均购自Cell Signaling Technology公司;小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体购自Santa Cruz公司;羊抗兔或羊抗小鼠IgG-AP二抗购自武汉博士德生物有限公司;BCIP/NBT试剂购自南京建成生物有限公司;SABC免疫组化试剂盒、BCA试剂盒、TRIzol裂解液及蛋白酶抑制剂等均购自武汉博士德生物有限公司;DAB显色试剂盒购自福州迈新生物有限公司。

1.2 动物与分组 SPF清洁级成年健康雄性SD大鼠45只，体质量(260±20)g，均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。将SD大鼠随机分为三组:①假手术组(仅给予头皮切开缝合，但不致伤)，②脑损伤组，③亚低温治疗组。根据各组取材时间点不同，每组又分为1 d、3 d、5 d三个亚组，每个亚组5只大鼠。

1.3 模型制备与亚低温处理 参照改良Marmarou’s法[4]制备临床常见的大鼠中度弥漫性脑创伤动物模型。脑损伤后立即将大鼠置于温控环境中诱导亚低温，诱导时间约为30 min，使大鼠肛温控制在31℃ ～33℃，并持续3 h。

1.4 脑组织水含量测定 各组大鼠在各时间相断头并快速取脑组织，采用干湿重法测定水含量。用滤纸吸干脑表面水分，电子分析天平称得湿重，后置入100℃烘箱烘烤至恒重，再称其干重。按公式计

算脑组织水含量:脑组织水含量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.5 免疫组织化学染色 脑组织标本经常规固定、脱水透明、石蜡包埋、连续冠状切片，按SABC免疫组化试剂盒说明进行操作。60℃烤片60 min，脱蜡至水，3%H2O2灭活 15 min，抗原热修复，5%BSA封闭20 min，甩干后分别滴加兔抗大鼠的TNF-α、IL-1β 及NF-κB 多克隆抗体(稀释浓度均为1∶50)，4℃冰箱过夜。羊抗兔或羊抗小鼠的IgG室温孵育30 min，SABC 室温 20 min，DAB 显色5 min，双蒸水终止显色，封片后置于光学显微镜下观察。

1.6 Western blot分析 取各组大鼠的皮层脑组织100 mg，蛋白裂解液裂解，12 000 r/min，4℃离心 15 min，收集上清液，-80℃保存备用。进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，

转移至PVDF膜上。5% 脱脂奶粉封闭1 h，兔抗大鼠的 TNF-α、IL-1β、NF-κB(稀释浓度均为 1∶500)，小鼠抗大鼠β-actin(稀释浓度为1∶500)，4℃孵育过夜。羊抗兔或羊抗小鼠的 IgG-AP，37℃孵育2 h，BCIP/NBT避光显色5 min，双蒸水终止显色。以Image J软件对蛋白表达条带进行灰度扫描及定量分析。以目标蛋白与 β-actin蛋白平均吸光度值(OD值)的比值作为分析对象。

1.7 统计学处理 用Excel建库，实验中所得数据均用x-±s表示，用SPSS16.0软件进行统计学分析。两组间比较选用t检验，单因素多组间比较用单因素方差分析，TNF-α和IL-1β与NF-κB相关关系采用 Pearson相关分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑组织含水量 Sham组脑组织含水量各时间点无明显差异，TBI组1 d即出现明显脑水肿，3 d水肿达高峰，5 d水肿逐渐消退，与Sham组相比均有统计学意义(P＜0.05)。亚低温治疗组各时间点较TBI组脑组织含水量明显减少(P＜0.05)。见表1。

2.2 脑皮质TNF-α的定位表达 TNF-α阳性细胞呈现棕褐色，主要分布在神经细胞及炎性细胞的细胞浆及细胞膜。Sham组偶见 TNF-α阳性细胞。TBI组大鼠1 d在损伤灶及其周围皮质可见较多深棕褐色阳性细胞，3 d及5 d有所减少。与TBI组同时相相比，亚低温治疗组TNF-α阳性细胞明显减少，见图1。

表1 各组大鼠脑组织的含水量(%，±s，n=10)Tab.1 Water content of brain tissue in each group(%， ± s，n=10)

表1 各组大鼠脑组织的含水量(%，±s，n=10)Tab.1 Water content of brain tissue in each group(%， ± s，n=10)

Note:Compared with Sham group，1)P ＜0.05;compared with TBI group，2)P ＜0.05.

Groups 1 d 3 d 5 d Sham group 77.49 ±0.37 77.81 ±0.41 77.62 ±0.28 TBI group 82.39 ±0.391)83.96 ±0.281)82.64 ±0.271) Treatment group 79.03 ±0.262)80.15 ±0.332)79.98 ±0.322)

表2 脑组织中TNF-α蛋白表达的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.2 Quantitative analysis of TNF-α expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

表2 脑组织中TNF-α蛋白表达的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.2 Quantitative analysis of TNF-α expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

Note:Compared with Sham group，1)P ＜0.05;compared with TBI group，2)P ＜0.05.

028 TBI group 1.225 ±0.0461)1.014 ±0.0321)0.904 ±0.0411) Treatment group 0.841 ±0.0372)0.682 ±0.0352)0.585 ±0.0292) Groups 1 d 3 d 5 d Sham group 0.219 ±0.024 0.193 ±0.016 0.202 ±0.

表3 脑组织中IL-1β蛋白表达的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.3 Quantitative analysis of IL-1β expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

表3 脑组织中IL-1β蛋白表达的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.3 Quantitative analysis of IL-1β expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

Note:Compared with Sham group，1)P ＜0.05;compared with TBI group，2)P ＜0.05.

027 TBI group 1.472 ±0.0491)1.183 ±0.0371)1.003 ±0.0381) Treatment group 0.906 ±0.0422)0.741 ±0.0352)0.681 ±0.0262) Groups 1 d 3 d 5 d Sham group 0.236 ±0.023 0.274 ±0.018 0.292 ±0.

图1 脑组织中TNF-α的表达(免疫组织化学染色，×400)Fig.1 Expression of TNF-α in brain tissue(Immunohistochemical staining，× 400)

图2 脑组织中IL-1β的表达(免疫组织化学染色，×400)Fig.2 Expression of IL-1β in brain tissue(Immunohistochemical staining，× 400)

图3 脑组织中NF-κB的表达(免疫组织化学染色，×400)Fig.3 Expression of NF-κB in brain tissue(Immunohistochemical staining，× 400)

表4 脑组织中NF-κB蛋白表达的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.4 Quantitative analysis of NF-κB expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

表4 脑组织中NF-κB蛋白表达的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.4 Quantitative analysis of NF-κB expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

Note:Compared with Sham group，1)P ＜0.05，compared with TBI group，2)P ＜0.05.

029 TBI group 0.968 ±0.0471)0.806 ±0.0381)0.764 ±0.0321) Treatment group 0.543 ±0.0362)0.415 ±0.0272)0.391 ±0.0212) Groups 1 d 3 d 5 d Sham group 0.285 ±0.025 0.279 ±0.033 0.309 ±0.

图4 Western blot检测脑组织中TNF-α蛋白的表达Fig.4 Expression of TNF-α in brain tissue by Western blot

图5 Western blot检测脑组织中IL-1β蛋白的表达Fig.5 Expression of IL-1β in brain tissue by Western blot

图6 Western blot检测脑组织中NF-κB蛋白的表达Fig.6 Expression of NF-κB in brain tissue by Western blot

2.3 脑皮质IL-1β的定位表达 IL-1β阳性细胞为细胞浆或细胞膜出现棕褐色颗粒，主要定位在神经胶质细胞和浸润的炎症细胞。Sham组少见IL-1β的表达。TBI组大鼠皮质区IL-1β阳性细胞较多，1 d达高峰，3 d及5 d有所减少。亚低温治疗组较TBI组同时间相相比IL-1β阳性细胞数减少。见图2。

2.4 脑皮质NF-κB的定位表达 NF-κB阳性细胞呈现棕褐色，主要分布在细胞浆和细胞核。Sham组偶见NF-κB阳性细胞。TBI组大鼠1 d即在皮质区出现较多NF-κB阳性细胞，伤后1 d即达高峰，3 d及5 d有所减少。与TBI组同时相相比，亚低温治疗组大鼠的NF-κB阳性细胞明显减少。见图3。

2.5 脑皮质TNF-α的定量表达 Sham组大鼠皮质区仅有微量TNF-α表达，TNF-α蛋白表达量在各时间点无变化;TBI组TNF-α的表达较Sham组明显增多(P＜0.05)，动态表达与免疫组化结果相吻合;亚低温治疗组TNF-α蛋白表达时程与TBI组相似，但表达减少，各时间点差异均具有统计学意义(P＜0.05)。见图4，表2。

2.6 脑皮质IL-1β的定量表达 Sham组大鼠皮质区IL-1β蛋白呈弱表达，且表达量在各时间点无变化;与Sham组相比，TBI组TNF-α的表达明显增多(P＜0.05)，动态表达与免疫组化结果相吻合;与TBI组同时相相比，亚低温治疗组TNF-α蛋白表达显著减少(P ＜0.05)。见图5，表3。

2.7 脑皮质NF-κB的定量表达 Sham组各时间相NF-κB有微量的基础表达;与Sham组相比，TBI组NF-κB的蛋白表达明显增多(P＜0.05)，动态表达与免疫组化结果相吻合;亚低温治疗组NF-κB的蛋白表达与 TBI组同时相相比明显减少(P＜0.05)。见图6，表4。

2.8 相关性分析 创伤性脑损伤后损伤皮质区NF-κB的蛋白表达与TNF-α的蛋白表达水平呈正相关(各组r值均大于0，假设检验P＜0.01);同时与IL-1β的蛋白表达水平也呈正相关(各组r值均大于0，假设检验 P ＜0.01)。

3 讨论

本次实验发现大鼠创伤后脑损伤后早期脑组织中 TNF-α、IL-1β和NF-κB升高，并维持高表达状态至伤后5 d，提示可能这些细胞因子间的相互作用引起炎症级联反应导致继发性脑损伤的发生与发展。NF-κB是炎症反应中关键性核转录因子，在非激活状态下，NF-κB与其抑制分子(I-κB)以无活性形式存在于胞浆中，不具备转录活性[5]，被激活后与I-κB发生解体，启动效应细胞中多种炎性因子的基因转录。基于这些推知 TBI后 NF-κB被激活，NF-κB可诱导脑组织效应细胞释放大量炎性细胞因子，其中以TNF-α和IL-1β为主。二者主要来源小胶质细胞，可使脑组织发生过度炎症反应，导致继发性脑损伤。

本实验就 TBI后 NF-κB的表达与 TNF-α(或IL-1β)的表达进行了相关性分析，结果显示NF-κB与 TNF-α(或 IL-1β)均呈正相关性，揭示 NF-κB 可能正向调控TNF-α和IL-1β蛋白的表达，从而引发炎症反应。TBI发生早期NF-κB的激活促进TNF-α和IL-1β的释放，同时，TNF-α和IL-1β的释放同样可以反过来激活 NF-κB，引发级联放大效应。这些细胞因子及其彼此间的相互作用共同维持组织过度的炎症反应，最终导致脑水肿、颅内压升高、神经细胞死亡及神经功能损害等继发性脑损伤。其中脑水肿是最主要的继发性脑损伤，是多种因素参与的复杂过程[6]。脑水肿是创伤性脑损伤早期死亡的主要原因，因此TBI发生后早期及时有效地控制脑水肿，可提高患者存活率。炎症反应、自由基以及血管通透性的改变是脑水肿发生的主要机制。另外2013年 Rossi等[7]利用TBI小鼠模型研究发现肌球蛋白轻链激酶(Myosin light-chain kinase，MLCK)增加脑组织的含水量，MLCK的抑制剂可缓解脑水肿，促进神经功能的恢复。本实验通过干湿重法测量各组大鼠脑组织的含水量，发现TBI后1 d即有明显脑水肿出现，3 d达水肿高峰，水肿一直持续到伤后5 d。水肿高峰比炎性因子高峰出现的滞后性可以用脑水肿发生的炎症机制解释。

TBI后急性期的治疗已经日趋成熟，但是对于TBI后多种继发性脑损伤的治疗尚没有好的方案。目前，减轻脑水肿正成为治疗继发性脑损伤的关键靶点。因为TBI后诱导的炎症反应在脑水肿的发生发展中具有重要作用，所以通过抑制与炎性反应相关细胞因子的表达或释放，对于脑水肿的治疗有十分重要的意义。近年来，随着亚低温(28℃ ～35℃)对多种疾病治疗的不断推广，多数国内研究已证实亚低温对TBI具有明显的脑保护作用[8-10]。国外临床研究显示亚低温可降低TBI患者的颅内压，改善脑神经功能的恢复，显著降低死亡率，且不产生任何严重并发症[11]。据报道治疗性亚低温的多效性与潜在机制与如下几点有关:降低脑代谢率，为氧的供给和需求之间营造平衡;减少自由基的形成;减少兴奋性神经递质的产生;防止神经细胞的死亡等[12，13]。Western blot结果显示:TBI后给予亚低温治疗可显著下调TNF-α、IL-1β和NF-κB的表达，同时降低脑组织含水量，促进脑损伤的恢复。

本研究发现 TNF-α、IL-1β 和 NF-κB 的高表达参与TBI的发生发展过程，成为脑水肿的形成机理之一。TBI后立即给予亚低温治疗可下调NF-κB活性，抑制炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的合成和释放，缓解炎症级联反应所导致的脑水肿的形成。本次实验完善了亚低温脑保护作用机制的研究，为亚低温临床应用提供理论及实验依据。

[1]Laker SR.Epidemiology of concussion and mild traumatic brain injury[J].PMR，2011，3(10):354.

[2]Zhang R，Liu Y，Yan K，et al.Antiinflammatory and immunomodulatory mechanisms of mesenchymal stem cell transplantation in experimental traumatic brain injury[J].J Neuroinflammation，2013，10(1):106.

[3]Tomura S，Vaccari JP，Keane RW，et al.Effects of therapeutic hypothermia on inflammasome signaling after traumatic brain injury[J].J Cereb Blood Flow Metab，2012，32(10):1939-1947.

[4]Marmarrou A，Foda MA，Vav DB，et al.A new model of diffuse brain injury in rats.Part I:Pathophysiology and biomechanics[J].Neurosurg，1994，80(2):291-300.

[5]Bakdwin AS Jr.The NF-KB and IkB Protein:new discoveries and insight[J].Ann Rev Immunol，1996，14:649-683.

[6]Gary AR.Neurological diseases in relation to the blood-brain barrier[J].J Cerebr Blood F Met，2012，32(7):1139-1151.

[7]Rossi JL，Todd T，Bazan NG，et al.Inhibition of myosin lightchain kinase attenuates cerebral edema after traumatic brain injury in postnatal mice[J].J Neurotrauma，2013，30(19):1672-1679.

[8]殷玉华，李 明，贾 锋，等.亚低温干预对创伤性颅脑损伤后N-甲基-D-天冬氨酸受体1表达的影响[J].上海医学，2013，36(4):361-365.

[9]殷玉华，李 明，贾 锋，等.亚低温干预对创伤性颅脑损伤大鼠海马组织CIB1表达的影响[J].上海交通大学学报(医学版)，2013，33(4):392-395.

[10]陆兆丰，贾 锋，邱永明，等.亚低温对创伤性脑损伤后线粒体α-酮戊二酸脱氢酶活性的影响[J].中华神经外科杂志，2006，22(11):659-662.

[11]Andrews PJ，Sinclair LH，Harris B，et al.Study of therapeutic hypothermia(32 to 35℃)for intracranial pressure reduction after traumatic brain injury(the Eurotherm3235Trial):outcome of the pilot phase of the trial[J].Trials，2013，14(1):277.

[12]Sinclair HL，Andrews PJ.Bench-to-bedside review:Hypothermia in traumatic brain injury[J].Crit Care，2010，14:204.

[13]Gibson A，Andrews PJ.Therapeutic hypothermia，still“too cool to be true?”[J].Prime Rep，2013，5:26.

[收稿2013-10-15 修回2013-12-11]
(编辑 倪 鹏)

Effect of mild hypothermia on expression of TNF-α，IL-1β and NF-κB after traumatic brain injury in rats

WANG Ya-Nan，ZHANG Yong，WANG Ning，LIU Xin-Ying.Department of Laboratory，Tangshan Workers’Hospital，Tangshan 063000，China

Objective:To investigate the expression of TNF-α，IL-1β and NF-κB in the cortex after traumatic brain injury in rats，in order to further explore the protective effects and possible mechanisms of mild hypothermia treatment.MethodsThe forty-five SD rats were randomly divided into Sham group，TBI group，treatment group.Rats model of TBI were established via Marmarou′s method.The animals were sacrificed at 1 d，3 d and 5 d post-TBI.The brain tissue was taken out to measure the water content based on wetdry weight method.The expression of TNF-α，IL-1β and NF-κB proteins were detected by Immunohistochemistry and Western blot analysis.ResultsCompared with the Sham group，the brain water content was increased(P ＜0.05)，reached peak at 3 d post-TBI，the expression of TNF-α，IL-1β and NF-κB was significantly increased(P ＜0.05)，reached peak at 1 d，sustained higher expression to 5 d post-TBI.Mild hypothermia treatment remarkably reduced the brain water content(P ＜ 0.05)，down-regulated TNF-α，IL-1β and NF-κB expression in comparision to the TBI group(P ＜0.05).ConclusionThe higher expression of TNF-α，IL-1β and NF-κB in the cortex may play an important role in the pathogenesis of TBI.Mild hypothermia can suppress NF-κB signaling pathway，reduce inflammatory reactions，relieve cerebral edema，finally promoting brain injury recovery.

Mild hypothermia;Traumatic brain injury;Brain edema;Rats

R322.8

A

1000-484X(2014)05-0618-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.010

①唐山市工人医院核医学科，唐山063000。

②通讯作者，E-mail:zy20131015@126.com。

王亚楠(1975年-)，女，主管检验师，主要从事脑损方面的研究。