鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对去卵巢大鼠骨质疏松症的改善作用

王姗姗，周晓春，李秀秀，薛长湖，王静凤*

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003）

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨密度降低、骨组织微结构改变而导致骨脆性和骨折危险性增高为特征的全身性骨骼疾病，其产生原因与骨重建过程中成骨细胞介导的骨生成和破骨细胞介导的骨吸收之间的平衡失调有关[1]。骨质疏松症已成为一个世界范围内越发严重的社会健康问题，据估计目前全世界患者人数已超过2 亿，其发病率已跃居常见病、多发病的第7位。骨质疏松症患者预计到2050年将增加到2.2 亿，其中 一半以上将发生在亚洲，绝大多数将在我国[2]。目前，市场上用于预防和治疗骨质疏松症的药物主要包括雌激素受体调节剂、双磷酸盐类、降钙素、氟制剂和VD及其活性代谢物类药物等[3]，但长期服用具有较强的毒副作用，因此寻找安全有效的防治骨质疏松症的生物活性物质已成为目前的研究热点。

鱼卵是水产加工的主要废弃物之一[4]。它含有丰富的蛋白质、脂肪、矿物质和多种维生素等，具有很高的营养价值[5]，但对鱼卵的高值化加工利用主要集中在功能脂质方面[6]。有关鱼卵糖蛋白的研究主要集中在胚胎发育[7]、分离纯化[8]、生化特性[9]、模式识别和作为污染标志物等发育生物学和生态毒理学方面，但在食品加工方面的研究和应用目前尚无发现。前期采用MC3T3-E1成骨细胞对不同水产动物卵进行活性筛选，研究结果表明，其唾液酸含量与增殖活性成正相关，其中鲫鱼卵的作用效果最好。上述调查研究可知鲫鱼卵具有潜在的利用价值和较大的开发空间。

本研究通过摘除双侧卵巢的方法建立骨质疏松症大鼠模型，从鲫鱼卵中提取唾液酸糖蛋白研究其对骨质疏松症的改善作用并探讨其作用机制，旨在为鲫鱼卵的高值化利用和抗骨质疏松症的药物开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与动物

鲜活雌性鲫鱼购于青岛大连路水产品市场。

健康SD大鼠，雌性，体质量（200±20）g，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.1.2 试剂

阿仑膦酸钠片 石家庄石药集团欧意药业有限公司；钙测定试剂盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；磷、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRACP）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；雌二醇（estradiol，E2）、脱氧吡啶啉（deoxypyridinoline，DPD）、组织蛋白酶K（cathepsin-K，Cath-K）、骨源性碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型前胶原羧基端前肽（propeptide carboxy-terminal procollagen，PICP）、骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、核因子κB受体活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）、核因子κB受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）酶联免疫吸附测定试剂盒美国R&D公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

LABOROTA 4000型旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；ALPHA 1-4 LO型冻干机 德国Christ公司；GL-20M型高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器公司；680型酶标仪 美国Bio-Rad公司；Agilent 1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白的制备和化学成分分析

活体雌性鲫鱼处死后取出新鲜成熟鱼卵，在低温条件下除杂、匀浆、冷冻干燥。干物加入95%乙醇脱脂，冷风干燥得脱脂鲫鱼卵。将脱脂鲫鱼卵干物按1∶30（m/V）的料液比加水，于4℃搅拌水提过夜，离心，45℃旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得鲫鱼卵唾液酸糖蛋白。采用二极管阵列串联高效液相色谱法检测鲫鱼卵唾液酸糖蛋白中唾液酸含量为5.89%，苯酚-硫酸法检测多糖含量为7.94%，福林-酚法检测蛋白质含量为44.25%，钼蓝比色法检测磷含量为1.78%。

1.3.2 骨质疏松症模型的建立及动物分组

采用双侧卵巢摘除法建立骨质疏松症模型。将雌性SD未交配大鼠适应性喂养7 d后，随机分为去卵巢组和假手术组，腹腔注射3.3 mL/kg的10%水合氯醛麻醉大鼠，去卵巢组摘除大鼠双侧卵巢，假手术组切除大鼠腹腔内一小块脂肪，术后连续3 d注射庆大霉素抗感染治疗，术后90 d大鼠尾静脉取血，检测E2含量、TRACP和ALP活性，以去卵巢组与假手术组相比大鼠血清E2水平显著降低（P＜0.01），TRACP和ALP活性显著升高（P＜0.01）判定大鼠成模。

将成模大鼠随机分为假手术组、模型对照组、阳性对照组、鲫鱼卵唾液酸糖蛋白组，每组10只。鲫鱼卵唾液酸糖蛋白组灌胃400 mg/（kg·d）鲫鱼卵唾液酸糖蛋白，阳性对照组灌胃1 mg/（kg·d）的阿仑膦酸钠，模型对照组和假手术组灌胃生理盐水。灌胃体积1 mL/100 g，每天1次，连续灌胃90 d。实验期间大鼠自由饮水，进食标准饲料，每3 d称量一次大鼠体质量。实验结束前5 d将大鼠放入代谢笼，收集24 h尿液，离心取上清，备用。于末次给药后，大鼠禁食不禁水12 h，经乙醚麻醉后腹主动脉采血，分离血清，备用。

1.3.3 尿液脱氧吡啶啉、钙、磷含量的测定

具体操作方法参照相应试剂盒说明书。

1.3.4 血清Cath-K、TRACP活性的测定

具体操作方法参照相应酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒说明书。

1.3.5 血清骨源性ALP活性和OCN、PICP含量的测定

具体操作方法参照相应ELISA试剂盒说明书。

1.3.6 血清OPG、RANK、RANKL含量的测定

具体操作方法参照相应ELISA试剂盒说明书。

1.4 统计学分析

数据分析采用SPSS11.0软件进行单因素方差分析，并采用LSD法进行两两比较，P＜0.05为差异显著，实验数据用±s表示。

2 结果与分析

2.1 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对骨质疏松症大鼠尿液DPD、Ca、P含量的影响

表1 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对骨质疏松症大鼠骨吸收指标的影响（±s，n==1100）Table1 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the indexes of bone absorption (± s,, n = 1100))

表1 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对骨质疏松症大鼠骨吸收指标的影响（±s，n==1100）Table1 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the indexes of bone absorption (± s,, n = 1100))

注：# #.与假手术组相比，差异极显著（P＜0.01）；*.与模型对照组相比，差异显著（P＜0.05）；**.与模型对照组相比，差异极显著（P＜0.01）。下同。

组别 DPD含量/（nmol/L） Ca含量/（mmol/L） P含量/（mmol/L） TRACP活力/（U/L） Cath-K含量/（pg/mL）假手术组 43.43±8.55 0.4 3±0.03 31.17±5.82 19.98±2.58 1 273.54±104.85模型对照组 82.20±8.09## 1.29±0.24## 53.51±2.74## 42.18±1.67## 2 450.90±153.01##阳性对照组 64.02±6.15** 0.93±0.23** 41.29±2.06** 30.80±1.26** 1 558.6±114.02**唾液酸糖蛋白组 60.69±5.92** 0.69±0.09** 33.32±1.62** 22.97±2.84** 1 489.32±118.80**

由表1可知，DPD是Ⅰ型胶原的分解产物，是反映骨吸收的特异性指标。模型对照组大鼠尿液DPD含量较假手术组显著升高；灌胃鲫鱼卵唾液酸糖蛋白后，DPD含量显著降低，与模型对照组相比降低了26.16%（P＜0.01）。去卵巢大鼠骨吸收增加，溶骨活性增强，骨中Ca、P释放进入血液循环，经肾脏后以尿液形式排出，因此尿液中Ca、P含量一定程度上反映骨盐丢失情况。模型对照组大鼠尿液Ca、P含量较假手术组显著升高；与模型对照组相比，灌胃鲫鱼卵唾液酸糖蛋白后Ca、P含量显著降低，分别降低了46.87%（P＜0.01）和37.73%（P＜0.01），且鲫鱼卵唾液酸糖蛋白的作用效果较阳性对照组药物作用效果更显著。结果表明鲫鱼卵唾液酸糖蛋白可有效抑制骨质疏松症大鼠骨吸收，防止骨矿盐丢失。

2.2 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对骨质疏松症大鼠血清TRACP、Cath-K活性的影响

由表1可知，TRACP由破骨细胞合成并分泌，它参与骨基质中固体钙磷矿化底物的降解；Cath-K是由破骨细胞分泌的一种能水解Ⅰ型胶原的蛋白酶，二者都是敏感的特异性骨吸收标志物。模型对照组大鼠血清TRACP、Cath-K活性较假手术组显著升高。灌胃鲫鱼卵唾液酸糖蛋白后二者活性均显著降低，与模型对照组相比，分别降低了45.55%（P＜0.01）和39.23%（P＜0.01），且鲫鱼卵唾液酸糖蛋白作用效果优于阳性对照组的药物作用效果。结果表明鲫鱼卵唾液酸糖蛋白可显著抑制骨质疏松症大鼠骨吸收。

2.3 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对骨质疏松症大鼠血清BALP活性和OCN、PICP含量的影响

表2 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对骨质疏松症大鼠骨生成指标的影响（±s，n==1100）Table2 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on serum indexes associated with bone formation (± s,, n = 1100))

表2 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对骨质疏松症大鼠骨生成指标的影响（±s，n==1100）Table2 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on serum indexes associated with bone formation (± s,, n = 1100))

组别 BALP活力/（U/L） OCN含量/（ng/mL） PICP含量/（ng/mL）假手术组 85.08±3.45 3.46±0.45 6.25±0.36模型对照组 190.01±6.65## 6.25±0.46## 8.61±0.53##阳性对照组 113.53±4.24** 3.85±0.32** 6.40±0.37**唾液酸糖蛋白组 103.97±4.93** 3.70±0.58** 6.45±0.25**

由表2可知，BALP是成骨细胞分泌的胞外酶，参与骨的矿化过程，可反映成骨细胞活性。与假手术组相比，模型对照组大鼠血清BALP活性升高了123.35%（P＜0.01）；灌胃鲫鱼卵唾液酸糖蛋白后，BALP活性显著降低，与模型对照组相比降低了45.28%（P＜0.01）。OCN是由成骨细胞合成并分泌的骨组织中最丰富的非胶原蛋白。模型对照组与假手术组大鼠相比血清OCN含量升高了80.94% （P＜0.01）；灌胃鲫鱼卵唾液酸糖蛋白后OCN含量降低了40.85%（P＜0.01）。

PICP与骨基质的重要组成成分Ⅰ型胶原的合成成正相关。与假手术组相比，模型对照组PICP含量显著升高；灌胃鲫鱼卵唾液酸糖蛋白后，PICP含量显著降低，与模型对照组相比降低了25.17%（P＜0.01）。结果表明鲫鱼卵唾液酸糖蛋白能有效抑制骨质疏松症大鼠高骨转换速率，防止骨丢失。

2.4 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对骨质疏松症大鼠血清OPG、RANK、RANKL含量的影响

表3 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对骨质疏松症大鼠血清OPG、RANNKK和RANKL含量的影响（±s，n==1100）Table3 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the contents of OPG, RANK and RANKL in serum (± s,, n = 1100))

表3 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对骨质疏松症大鼠血清OPG、RANNKK和RANKL含量的影响（±s，n==1100）Table3 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the contents of OPG, RANK and RANKL in serum (± s,, n = 1100))

组别 OPG含量/（pg/mL） RANK含量/（pg/mL） RANKL含量/（pg/mL） RANKL/OPG假手术组 12.47±1.45 34.44±3.09 15.75±1.01 1.27±0.14模型对照组 7.01±1.08## 36.27±5.82# 29.42±3.07## 4.29±0.86##阳性对照组 9.23±1.18** 30.77±4.16* 21.72±1.81** 2.37±0.28**唾液酸糖蛋白组 10.97±0.62** 28.70±2.65* 19.80±1.86** 1.77±0.11**

由表3可知，OPG和RANKL由成骨细胞分泌，RANK由破骨细胞前体细胞分泌，OPG通过竞争性地与RANKL结合，可阻断RANKL与RANK的相互作用，抑制破骨细胞增殖分化，因此RANKL和OPG的比值决定了骨吸收的程度。模型对照组血清OPG含量显著低于假手术组，RANK、RANKL含量显著高于假手术组，且模型对照组RANKL/OPG比值与假手术组相比升高了236.37%（P＜0.01）。灌胃鲫鱼卵唾液酸糖蛋白后，与模型对照组相比，OPG含量降低了56.50%（P＜0.01），RANK含量降低了20.87%（P＜0.05），RANKL含量降低了32.69%（P＜0.01），RANKL/OPG比值降低了58.74%（P＜0.01），且鲫鱼卵唾液酸糖蛋白作用效果优于阳性对照药物的作用效果。结果证明鲫鱼卵唾液酸糖蛋白能通过下调RANKL/OPG比值来抑制破骨细胞形成，从而抑制骨吸收。

3 讨 论

切除卵巢是复制骨质疏松症模型的经典方法，与临床上绝经后骨质疏松症极为相似。绝经后骨质疏松症的动物模型是由Saville[10]于1969年首先用大鼠建立的，由于大鼠去卵巢后的骨丢失与妇女绝经后的骨丢失有许多相似之处，故去卵巢大鼠骨质疏松症模型已成为标准化的、公认的研究绝经后妇女骨质疏松症的经典病理模型[11]，目前已在国内外广泛的应用[12-13]。本实验通过切除大鼠双侧卵巢建立骨质疏松症模型，以鲫鱼卵唾液酸糖蛋白为受试物研究其对骨质疏松症的改善作用，测定骨吸收、骨生成指标和OPG、RANK、RANKL含量，并对其作用机制进行初步探索。结果显示，鲫鱼卵唾液酸糖蛋白可显著降低骨质疏松症大鼠骨吸收和骨生成指标，改善大鼠高骨转换状态，显著下调血清RANKL含量，上调OPG含量，降低RANKL/OPG比值。

骨代谢主要以骨重建形式进行，在调节激素和局部细胞因子等协同作用下，不断吸收旧骨，生长新骨，周而复始，循环进行，形成了体内骨骼相对稳定状态。破骨细胞介导的骨吸收相对增强，或者成骨细胞介导的骨生成相对减弱，使骨净吸收增加，骨微结构紊乱，最终导致骨质疏松症发生[14]。在骨吸收发生时，骨的Ⅰ型胶原会分解生成DPD，释放到血液中并以原形直接经肾脏以尿液形式排出[15]。Ca、P主要作用是促进骨基质的合成和骨矿沉积，当骨丢失严重时，尿液中Ca、P含量升高。TRACP由破骨细胞合成并直接分泌进入血液循环，半衰期长，稳定性好，可反映破骨细胞活性和骨吸收状况[16]。Cath-K是破骨细胞分泌的一种半胱氨酸蛋白酶，能水解Ⅰ型胶原等骨基质蛋白，是重要的破骨细胞分子标记物和骨吸收标志性指标[17]。实验结果显示鲫鱼卵唾液酸糖蛋白可显著降低去卵巢大鼠尿液DPD、Ca、P含量，显著抑制血清Cath-K、TRACP活性。表明鲫鱼卵唾液酸糖蛋白具有抑制骨质疏松症大鼠骨吸收，防止骨矿盐丢失的作用。

当骨中钙盐沉积不足时，成骨细胞对BALP的分泌增多，BALP是评价骨矿化障碍的最佳指标[18]。OCN可用于直接反映骨生成的速率[19]，它是骨组织中最丰富的非胶原蛋白，骨更新速率越快，成骨细胞分泌OCN越多。Ⅰ型胶原是骨基质的重要组成成分，PICP与Ⅰ型胶原的合成呈正相关[20]。实验结果显示，鲫鱼卵唾液酸糖蛋白可显著降低去卵巢大鼠血清BALP活性和OCN、PICP含量。表明鲫鱼卵唾液酸糖蛋白具有抑制骨质疏松症大鼠高骨转换速率，防止骨丢失的作用。

OPG/RANKL/RANK系统是成骨细胞作用于破骨细胞的重要途径，是目前骨质疏松症防治的一个重大突破[21]。OPG和RANKL主要由成骨细胞分泌，其中，RANKL通过与破骨细胞表面靶信号受体RANK作用，促进破骨细胞增殖、分化、成熟和活化，引起骨吸收。而OPG可竞争性地与RANKL结合，从而阻断骨吸收信号的传递。因此，RANKL/OPG的比例是骨吸收的关键因素之一[22]。实验结果显示，鲫鱼卵唾液酸糖蛋白可显著上调去卵巢大鼠血清OPG含量，下调RANKL含量，降低RANKL/OPG比值。表明鲫鱼卵唾液酸糖蛋白具有抑制破骨细胞增殖分化，防止骨吸收的功能。

综上所述，鲫鱼卵唾液酸糖蛋白能显著调节骨质疏松症大鼠骨代谢，抑制高骨转换速率，防止骨丢失。其抗骨质疏松症的作用机制可能与RANKL/OPG比值下调相关，但其具体的作用机制有待进一步研究。

[1]KAKU M, ROCABADO J M R, KITAMI M, et al.Royal jelly affects collagen crosslinking in bone of ovariectomized rats[J].Journal of Functional Foods, 2014, 13(7): 398-406.

[2]杨希重.番茄红素对去卵巢大鼠骨质疏松症防治作用的实验研究[D].青岛: 青岛大学, 2008.

[3]史传道, 樊晓晨, 邓海东.抗疏健骨颗粒对骨质疏松模型大鼠骨密度和骨生物力学的影响[J].河南中医, 2012, 32(7): 831-833.

[4]陆丽丽, 陈舜胜.鲤、鲫卵的脂质和脂肪酸特性[J].食品科学, 2007,28(12): 100-104.

[5]代忠波, 丁卓平, 刘承初, 等.三种淡水养殖鱼鱼卵的营养价值评价[J].营养学报, 2007, 29(1): 103-104.

[6]陈文娟.大黄鱼鱼卵磷脂的提取、鉴定及抗氧化活性研究[D].福州: 福建农林大学, 2010.

[7]黄金善, 范兆廷, 贾忠贺, 等.沉性大卵径鱼卵的观察方法与虹鳟的胚胎发育[J].经济动物学报, 2006, 9(4): 235-238.

[8]宋川, 李艳芳, 任阳阳, 等.鲢鱼卵高分子质量 CPI-I 的纯化与鉴定[J].食品科学, 2012, 33(13): 100-103.

[9]岳振宇, 蒋一珪, 单仕新.雌核发育和两性融合发育鱼卵调控精核受精发育的生化特性研究[J].水生生物学报, 1996, 20(2): 164-172.

[10]SAVILLE P D.Changes in skeletal mass and fragility with castration in th e rat; a model of osteoporosis[J].Journal of the American Geriatrics Society, 1969, 17(2): 155-166.

[11]廖进民, 黄连芳, 陈艳, 等.己烯雌酚防治去卵巢大鼠股骨颈骨质疏松的实验研究[J].中国临床解剖学杂志, 2009, 27(5): 573-576.

[12]XIA Bingjiang, XU Bing, SUN Yan, et al.The effects of liuwei dihuang on canonial Wnt/β-catenin signaling pathway in osteoporosis[J].Journal of Ethnopharmacology, 2014, 153(1): 133-141.

[13]邢志军, 陈德喜, 赵景明.壮骨颗粒对去卵巢大鼠骨质疏松症的影响[J].中国当代医药, 2014, 21(6): 8-10.

[14]刘明, 潘薇, 陈德才.甲状旁腺激素治疗骨质疏松的研究进展[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志, 2012, 5(2): 151-156.

[15]程敏, 王庆伟, 刘雪英, 等.女贞子治疗去卵巢大鼠骨质疏松的实验研究[J].中国药理学通报, 2013, 29(2): 229-233.

[16]汪四海, 刘健, 张金山, 等.按不同临床因素分组比较强制性脊柱炎患者血清骨钙素、抗酒石酸酸性磷酸酶的变化[J].中国临床保健杂志, 2013, 16(6): 587-590.

[17]唐全勇, 贾志宇, 赵云转, 等.咖啡酸对破骨细胞形成及组织蛋白酶K基因表达的抑制[J].中国组织工程研究, 2012, 16(46): 8561-8565.

[18]肖恩.骨质疏松骨代谢生化指标的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2008, 14(3): 212-216.

[19]魏双平, 李蒙, 李瑞玉, 等.传统中药对成骨细胞及骨钙素合成的影响[J].中国组织工程研究, 2013, 17(11): 2083-2090.

[20]陈树清, 周厚明, 孙保国, 等.补肾方对去卵巢大鼠血清中PICP、ICTP 的影响[J].中国中医骨伤科杂志, 2009, 17(3): 13-14.

[21]VIJAYAN V, KHANDELWAL M, MANGLANI K, et al.Homocysteine alters osteoprotegerin/RANKL system in the osteoblast to promote bone loss: pivotal role of redox regulator forkhead O1[J].Free Radical Biology and Medicine, 2013, 61: 72-84.

[22]ALCANTARA E H, SHIN M Y, SOHN H Y, et al.Diosgenin stimulates osteogenic activity by increasing bone matrix protein synthesis and bone-specific transcription factor Runx2 in osteoblastic MC3T3-E1 cells[J].The Journal of Nutritional Biochemistry, 2011,22(11): 1055-1063.