糖谱法比较不同产地竹荪多糖结构特征

吴定涛，巨瑶君，陆静峰，赵 静，李绍平*

（澳门大学中华医药研究院，中药质量研究国家重点实验室，澳门 999078 ）

长裙竹荪（Dictyophora indusiata）隶属于担子菌亚门、鬼笔科、竹荪属，被誉为“菌中皇后”，是我国著名的食用菌[1-3]。现代药理研究证实，多糖作为长裙竹荪的主要活性物质，具有调节机体免疫力[4]，抑制肿瘤和癌细胞生长[5-6]，抗氧化[7-9]等活性。实际上，多糖的生物活性与其单糖组成及比例、糖苷键类型及顺序、分子质量、粒径、溶液链构象等密切相关[10-12]。因此，为评价长裙竹荪质量，对其多糖进行比较研究是十分必要的。然而，由于多糖结构的复杂性，目前尚无比较不同产地长裙竹荪多糖的报道。

高效凝胶排阻色谱联用多角度激光光散射（high performance size exclusion chromatography coupled with multi-angle laser light scattering，HPSEC-MALLS）能够准确测定多糖分子参数，包括重均分子质量（molecular weight，Mw）及其分布、回旋半径以及溶液链构象等，并已成功用于香菇多糖[13]注射液质量评价。另外，糖谱法是我们提出的一种多糖定性定量分析方法[14-17]，糖谱法联用荧光辅助凝胶电泳（polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis，PACE）已成功应用于不同来源灵芝多糖、天然虫草多糖、北虫草多糖以及手掌参多糖的质量研究[18-22]。本研究将结合使用HPSECMALLS和糖谱法联用PACE比较研究长裙竹荪多糖结构特征，提高竹荪多糖及其产品质量控制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

四川宜宾（样品DI1）、福建莆田（样品DI2）、四川青川（样品DI3、DI4、DI5、DI6）共6批来至不同产地长裙竹荪由无限极（中国）有限公司提供，经鉴定为Dictyophora indusiata (Vent.Pers.) Fisch.子实体。

右旋糖酐酶（E C 3.2.1.1 1）、α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）和果胶酶（EC 3.2.1.15） 美国Sigma公司；昆布二糖（95%）、昆布三糖（95%）、昆布四糖（95%）、昆布六糖（95%）、β-1,3-葡聚糖苷酶（EC 3.2.1.39）、β-葡聚糖苷酶（EC 3.2.1.6）、β-2,1-菊粉酶（EC 3.2.1.7） 爱尔兰Megazyme公司；8-氨基1,3,6-萘三磺酸二钠盐 日本东京化学工业株式会社；聚丙烯酰胺凝胶 美国伯乐公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

微波辅助提取仪 奥地利安东帕公司；凝胶电泳分析仪 美国伯乐公司；凝胶成像系统 英国Syngene公司；多角度激光光散射、示差检测器 美国怀亚特公司；紫外检测器（diode array detector，DAD）、高效液相色谱仪 美国安捷伦科技公司；凝胶排阻色谱柱（TSK Gel G6000pwxl和TSK Gel G3000pwxl） 日本东曹公司。

1.3 方法

1.3.1 微波辅助提取长裙竹荪多糖

样品经干燥、打粉后，采用微波辅助提取仪制备长裙竹荪子实体粗多糖。分别取1 g样品进行提取，提取条件为微波功率500 W，温度120℃，提取时间15 min，料液比1∶20（m/V）。随后将提取液浓缩至10 mL，加入4倍体积的乙醇（体积分数95%）沉淀粗多糖。沉淀再用去离子水复溶，高速离心去除水不溶物后，低压冷冻干燥机冻干上清液，获得长裙竹荪多糖。

1.3.2 长裙竹荪多糖HPSEC图谱构建和分子质量及其分布测定

采用美国怀亚特示差检测器（refractive index detector，RID）测定长裙竹荪多糖比折光指数增量值（dn/dc），即取粗多糖10 mg，配制成终质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的水溶液各3 mL，样品经0.45 μm滤膜过滤后，采用RI-batch模式测得长裙竹荪多糖dn/dc值为0.145 mL/g。

采用HPSEC-MALLS/RI构建长裙竹荪多糖HPSEC图谱及测定分子质量分布，并联用DAD在线检测样品UV280 nm吸收。色谱条件：流动相为0.9 g/100 mL的氯化钠水溶液；色谱柱柱温35℃；流速0.5 mL/min；色谱柱TSK Gel G6000pwxl串联TSK Gel G3000pwxl；样品质量浓度约为2.5 mg/mL；进样量100 μL；采用Astra 6软件收集及处理数据。

1.3.3 长裙竹荪多糖PACE特征性糖谱构建

1.3.3.1 长裙竹荪多糖精制

取长裙竹荪多糖冻干粉末各20 mg，溶于10 mL去离子水中，采用分子截留量为3 000 D的离心超滤管处理样品，即高速离心超滤（4 000×g，25 min），并重复上述过程步骤5次，以去除样品中分子质量低于3 000 D小分子化合物，再采用苯酚-硫酸法测定总多糖含量[23]，以调节用于酸和酶催化水解的多糖样品量。

1.3.3.2 长裙竹荪多糖部分酸水解

取超滤处理后的多糖溶液200 μL（约0.5 mg）若干份，加入1.5 mol/L三氟乙酸100 μL，混匀。随后将混合液置于80℃保温5 h。反应结束后，采用氮吹干燥仪干燥酸水解产物，并加入适量甲醇清洗水解产物，以去除水解产物中残留的三氟乙酸，干燥产物用于后续衍生化处理；另以不加三氟乙酸水解的长裙竹荪多糖溶液为空白对照作平行处理。

1.3.3.3 长裙竹荪多糖酶水解

取超滤处理后的多糖溶液200 μL（约0.5 mg）若干份，分别加入右旋糖酐酶、β-1,3-葡聚糖苷酶、β-葡聚糖苷酶、果胶酶、α-淀粉酶和β-2,1-菊粉酶至终浓度为2、2、2、20、20、2 U/mL，随后将混合液置于40℃保温12 h。反应结束后，将混合液置于80℃保温20 min，终止酶催化水解。采用高速离心去除变性后的酶蛋白，随后在35℃条件下氮吹干燥上清液，获得多糖酶解产物。另以不添加糖苷水解酶长裙竹荪多糖溶液作为空白对照。另分别取右旋糖酐70、燕麦葡聚糖、可溶性淀粉、聚半乳糖醛酸各0.5 mg，分别加入右旋糖酐酶、β-葡聚糖苷酶、α-淀粉酶和果胶酶在上述相同条件下反应，酶水解产物作为阳性对照。最后，酶水解产物按之前报道的方法进行衍生化处理[18-19]后分析。

1.3.3.4 长裙竹荪多糖水解产物电泳分析

荧光辅助凝胶电泳按报道的方法[18-19]进行。即采用垂直板凝胶电泳分离多糖部分酸水解、酶水解产物，分离胶和浓缩胶分别为0.1 mol/L Tris-boric（pH 8.2）配制的30 g/100 mL和8 g/100 mL的聚丙烯酰胺凝胶。电泳缓冲液为0.1 mol/L Tris-boric（pH 8.2）。上样量为1～3 μL，首先采用200 V进行电泳分离20 min，随后采用700 V进行电泳分离45 min。所有的样品均至少重复电泳分析3次。凝胶在UV365 nm条件下成像。

1.4 数据分析

采用Quantity-One 软件（版本4.6.2，美国伯乐公司）扫描PACE凝胶图上各条带光密度值，生成电子扫描特征图谱，随后采用计算机辅助相似性评价系统（版本1.290，由中南大学中药现代化研究中心及香港理工大学开发）创建各电子扫描特征图谱共有模式图谱并计算各特征图谱与共有模式图谱之间的相关系数。

2 结果与分析

2.1 长裙竹荪多糖HPSEC图谱及分子质量分布

多糖分子质量及其分布、粒径、溶液链构象等与多糖的生物活性密切相关[10]，并且多糖溶液链构象已被用于多糖的质量控制研究[13,22]。因此，本研究采用HPSECMALLS构建不同产地长裙竹荪多糖HPSEC图谱，并准确测定其分子质量及分布，研究结果有利于提高长裙竹荪多糖的质量控制。不同产地长裙竹荪多糖HPSEC图谱见图1，重均分子质量及其分布见表1。结果表明不同产地长裙竹荪多糖HPSEC图谱中均有相似的色谱峰，色谱峰1和2基本无紫外吸收，其分子质量及其分布也类似（表1）。由于S E C柱分离能力较弱，分子质量相对较小的化合物（分子质量小于5 000 D）均在36.5～40.0 min之间洗脱，结果导致色谱峰3分子质量不能准确测定（误差＞15%）。

图1 不同产地长裙竹荪多糖HPSEC色谱图（dRI信号和UV 280 nm吸收）Fig.1 HPSEC chromatograms of polysaccharides in D.indusiata collected from different places of China

表1 不同产地长裙竹荪多糖分子质量及其分布Table1 Molecular weights and their distribution of polysaccharides from D.indusiata

2.2 长裙竹荪多糖部分酸水解产物特征糖谱

图2A表明各长裙竹荪多糖样品在水解前不含小分子糖类化合物。不同产地长裙竹荪多糖的部分酸水解产物PACE特征图谱基本一致（图2B）。此外，采用Quantity-One软件采集PACE特征图谱中各条带光密度值，构建部分酸水解产物扫描图，并用计算机辅助相似性评价系统计算部分酸水解产物扫描图共有模式图谱，同时计算各样品与共有模式之间相似度。结果：不同产地长裙竹荪多糖部分酸水解产物与其共有模式之间的相关系数值见表2，平均相关系数值为0.957±0.039（n = 6），提示不同产地长裙竹荪多糖具有相似的部分酸水解特征。然而酸水解选择性差，特异性酶水解有利于研究长裙竹荪多糖化学结构特征。

表2 长裙竹荪多糖与其共有模式相关系数Table2 Correlation coefficient of each sample of D.indusiiaattaa to their simulative mean chromatogrraamm

2.3 长裙竹荪多糖酶水解产物特征性糖谱

糖谱法是针对多糖结构特征建立的一种特异性强、选择性高的表征多糖化学特征性图谱的新方法[14]，糖谱法联用PACE具有高效分离能力和高通量处理能力等优势[18-19]，并且荧光标记检测具有很高的灵敏度，明显优于常用的示差检测器和蒸发光检测器[10]。因此，本实验采用糖谱法结合PACE方法分析比较不同产地长裙竹荪多糖6种酶水解产物，PACE特征性图谱见图3。结果表明：不同产地长裙竹荪多糖均能被β-1,3-葡聚糖苷酶（图3A）、β-葡聚糖苷酶（图3B）、α-淀粉酶（图3C）、右旋糖酐酶（图3D）、β-2,1-菊粉酶（图3E）以及果胶酶（图3F）催化水解成小分子糖类化合物，说明长裙竹荪多糖含有β-1,3-葡萄糖苷键，β-1,4-葡萄糖苷键，α-1,4-葡萄糖苷键，α-1,6-葡萄糖苷键、β-2,1-果糖苷键和α-1,4-半乳糖醛酸苷键等。此外，长裙竹荪多糖α-淀粉酶水解产物与可溶性淀粉水解产物不同（图3C），且长裙竹荪多糖对碘-碘化钾试液不显色，说明长裙竹荪多糖中的α-1,4-葡萄糖苷键不是源自淀粉类化合物。表2总结了不同产地长裙竹荪多糖酶解产物与其共有模式之间的相关系数值，结果进一步证实不同产地长裙竹荪多糖十分相似（平均相关系数值均大于0.95）。

图3 不同产地长裙竹荪多糖酶解产物PACE特征性图谱Fig.3 PACE fingerprints of enzymatic hydrolysates of polysaccharides from D.indusiata

3 结 论

不同产地长裙竹荪多糖具有很高的相似性，长裙竹荪多糖含有β-1,3-葡萄糖苷键，β-1,4-葡萄糖苷键，α-1,4-葡萄糖苷键，α-1,6-葡萄糖苷键、β-2,1-果糖苷键和α-1,4-半乳糖醛酸苷键等。本研究结果有利于表征竹荪多糖的化学特征，提高长裙竹荪多糖质量控制。

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