m iR-106b靶向调控胰岛素分泌细胞诱导分化过程中Ngn3基因的表达

陈修思，王 涛，穆长征，王小梅，田 鹤辽宁医学院 组织胚胎学教研室，辽宁锦州 000；辽宁医学院附属第一医院 老年医学科，辽宁锦州00

微小RNA(miRNA)是一类内源性小的非编码RNA(small noncoding RNA)，通过与靶基因mRNA的3'UTR区完全或部分互补，进而降解该目的mRNA或阻止其翻译成相关蛋白，下调靶基因表达[1]。神经元素3(neurogenin 3，Ngn3)是胰腺内分泌细胞发育的重要标志，调控胰岛干细胞的发育和分化，促进胰岛B细胞的再生[2-5]。本研究应用活化素A和B细胞素诱导小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，bMSCs)分化为胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells，IPCs)，利用生物信息学对miR-106b和Ngn3基因的靶向匹配关系进行预测并通过双荧光素酶报告基因系统鉴定，qRT-PCR检测诱导分化过程中miR-106b和Ngn3的表达，以阐明miR-106b对Ngn3基因表达的调控作用。

材料和方法

1 材料 1)实验动物：C57BL/6小鼠，4 ~ 8周龄，体质量20 ~ 30 g，购于中国医科大学实验动物部，生产许可证SCXK(辽)2008-0005。2)菌株、质粒和细胞系：E.coli DH5α感受态细胞和pMD 18-T载体购自TaKaRa公司，pmirGLO载体购自Promega公司，NIH3T3细胞系为辽宁医学院组织胚胎学教研室保存。3)主要试剂：HG-DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和胰蛋白酶购于Hyclone公司，活化素A和B细胞素购自Sigma公司，兔抗小鼠胰岛素抗体购自Santa Cruz公 司，RNAiso Plus、RNAiso for small RNA、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ、限制性内切酶，Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司，miRNA模拟物由GenePharma公司合成，Dual-Luciferase®报告基因检测系统购自Promega公司。

2 胰岛素分泌细胞的诱导分化及鉴定 1)IPCs的诱导分化：取6 ~ 8周C57BL/6小鼠，脱颈处死，取其股骨和胫骨，反复冲出骨髓，接种到25 cm2培养瓶内，于37℃、5% CO2培养箱中培养，每3 ~ 4 d换1次液，待细胞达到80%融合后，用0.25%胰酶和0.02% EDTA消化，收集细胞1∶2传代，记作P1。取P3细胞做诱导分化，培养基中加入2 nmol活化素A和1 nmol B细胞素，培养2周。2)双硫腙(dithizone，DTZ)染色检测：参考Jindal[6]的方法，向培养瓶内加入DTZ工作液(10 g/L)，37℃，水浴10 min，镜检，摄片。3)免疫荧光检测胰岛素的表达：取分化后的细胞，1 000 r/min离心，以106/ml的细胞浓度涂片，在冷空气中迅速干燥，用10%甲醛固定30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，0.1% BSA封闭1 h，加兔抗小鼠胰岛素抗体，室温孵育1 h，PBS冲洗3次，每次5 min，二抗加FITC标记山羊抗兔IgG抗体，抗体浓度(1∶200)，Hochest 33258复染细胞核。

3 生物信息学预测 采用靶基因预测软件mi-Randa(http：//www.microrna.org)和 TargetScan (http：//www.targetscan.org)对miR-106b和Ngn3基因的靶向匹配关系进行预测。

4 miR-106b靶基因Ngn3的鉴定 1)Ngn3 3'UTR的克隆：取诱导培养15 d的IPCs，加入RNAiso Plus提取总RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒(PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit)说明，反转录为cDNA，利用正向引物5'ccgagctctcgcctcttct ggctttcac 3'和反向引物5'gctctagactagggctttccggttcaca 3'扩增Ngn3 mRNA的3'非翻译区(3'UTR)片段，并按AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明回收目的片段，克隆到pMD 18-T载体上，测序。2)Ngn3 3'UTR-pmirGLO荧光素酶报告载体的构建：分别用SacⅠ和XbaⅠ双酶切pmirGLO质粒载体以及回收得到的Ngn3 3'UTR，按TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.0说明，将回收得到的Ngn3 3'UTR酶切片段与pmirGLO载体酶切片段相连，构建Ngn3 3'UTR-pmirGLO荧光素酶报告载体，转化入DH5α感受态细胞中克隆扩增，按照AxyPrep质粒DNA小量试剂盒说明从菌液中提取重组质粒，用Sac I和Xba I酶切质粒鉴定。3)NIH3T3细胞转染与荧光素酶检测：NIH3T3细胞培养在含10%FBS的DMEM培养基中，转染前1 d，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90% ~95%。对于每孔细胞，利用Lipofectamine 2000转染Ngn3 3'UTR-pmirGLO 200 ng以及miR-106b模拟物或对照miRNA 30 nmol，转染24 h后，按照Promega公司Dual-Luciferase®报告基因检测系统说明检测不同处理组的荧光强度。每个处理组设置3个重复，每个转染实验重复3次。

5 qRT-PCR检测miR-106b及Ngn3的表达 取诱导4 d、7 d、10 d、13 d和16 d的细胞，分别加入RNAiso for small RNA或RNAiso Plus提取总miRNA或总RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒(One Step Prime-Script®miRNA cDNA Synthesis Kit)说明进行反转录，得到的cDNA样品稀释4倍，加入SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ和miR-106b检测引物(通用检测引物试剂盒自带)或Ngn3检测引物(表1)，以U6或GAPDH为内参基因，在Chromo4TM多色实时定量PCR仪(Biorad)上进行40个循环的qPCR反应，应用Opticon-3软件对反应结果进行定量分析。每次定量分析检测样品设置3个重复，以3批样品进行独立表达分析。

表1 引物序列Tab. 1 Sequences of primers for RT-PCR

6 统计学分析 应用SPSS13.0统计软件处理数据，统计资料以-x±s表示，组间比较进行t检验，P＜0.01为差异有统计学意义。

结 果

1 诱导后细胞形态学观察 bMSCs传至3 ~ 4代，细胞均匀分布，形态规则均一，呈长梭形，折光性强。诱导分化后的细胞变成圆形、椭圆形，并且成团悬起(图1A)；DTZ染色呈猩红色，提示细胞中有锌离子参与胰岛素的合成(图1B)；细胞免疫荧光显示分化2周后的细胞内有胰岛素表达，显示绿色荧光(图1C)。

2 miR-106b和Ngn3靶向匹配关系 TargetScan结果表明miR-106b在Ngn3 mRNA的3'UTR上有一个脊椎动物间保守的靶位点，靶位点类型为7merm8，“context + score”百分数为83，表明其与靶位点互补情况良好。miRanda显示miR-106b与靶位点匹配的mirSVR 得分为-0.453 6，表明miRNA与3'UTR结合情况良好，见表2。

3 miR-106b可直接调控Ngn3的表达 为分析miR-106b能否调控Ngn3的表达，我们首先克隆Ngn3 3'UTR并插入到pmirGLO载体荧光素酶基因下游，获得报告载体Ngn3 3'UTR-pmirGLO，然后将Ngn3 3'UTR-pmirGLO以及化学合成的miR-106b或对照miRNA(在小鼠细胞系中无任何靶基因)共转染进NIH3T3细胞系中，通过荧光强度分析荧光素酶表达变化，进而分析miR-106b对Ngn3表达的影响。相对于对照miRNA，miR-106b能使Ngn3 3'UTR-pmirGLO的荧光素酶表达水平下降为 (52.71±4.93)%(图 2)。

4 IPCs诱导分化过程中miR-106b和Ngn3的表达qRT-PCR对诱导4 d、7 d、10 d、13 d和16 d的细胞进行检测，发现如果将诱导4 d细胞mRNA的表达量值设为1，则诱导7 d Ngn3 mRNA的表达量为4.13±1.74，诱导16 d升至13.25±6.07倍，而miR-106b的表达量诱导7 d下降为(58.98±7.42)%，诱导16 d下将至(19.65±5.83)%(图3)。结果表明，在IPCs诱导分化过程中miR-106b的表达水平与Ngn3表达呈负相关，与荧光素酶报告系统检测结果相符。

讨 论

Ngn3是胰岛发育过程中的一个关键性调控因子。White等[7]采用基因工程技术构建了Ngn3启动子的报告基因载体，随后将基因敲入分离的模型小鼠胚胎胰腺前体细胞，检测这些前体细胞及其后裔细胞的基因表达，发现在胰腺发育过程中，有1 029个基因参与表达，其中有237个基因是参与调控的转录因子。Castaing等[8]将外源胰岛素基因导入胰岛干(祖)细胞，通过示踪技术证实，胰岛干细胞可以向内分泌细胞分化，并在分化过程中持续高效表达Ngn-3。研究表明，运用钳住小鼠胰腺管使得消化酶无法进入小肠的实验手段损伤小鼠的胰腺，以寻找能转变成B细胞的胰腺细胞，结果在胰腺损伤后3 d内，研究人员发现了表达Ngn3的细胞，当将带有Ngn3的细胞注入从小鼠胚胎取出的胰腺中后，这些Ngn3阳性细胞发育成B细胞并产生了胰岛素，阻止这一基因的表达则减少B细胞的增殖，这些结果表明这些Ngn3阳性细胞在小鼠受伤的胰腺中形成了新的B细胞[9]。

表2 m iR-106b 与Ngn3 3'UTR之间预测的配对关系Tab. 2 M atch relation between m iR-106b and Ngn3 3'UTR

miRNA作为一类小的内源性非编码RNA已被证实广泛参与生命活动过程中的基因表达调控[10-13]；Joglekar等[14]应用microarry筛选发现miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195与Ngn3的转录后抑制有关，功能研究进一步证实，这些miRNA能抑制Ngn3蛋白的表达，过表达这些miRNA可以抑制Ngn3转录因子的产生，进而导致胰岛成熟内分泌细胞数目减少。但miRNA参与胰岛B细胞的诱导分化却知之甚少，为此，本研究运用靶基因预测软件miRanda和TargetScan对miR-106b和Ngn3基因的靶向匹配关系进行预测，发现二者匹配关系良好。miRanda是Enright等[15]开发的第一个靶基因预测软件，其适用范围宽广，不受物种限制，除了传统的miRNA与靶基因碱基互补方面的要求外，Betel等[16]更新了算法—mirSVR，其是一种新的机器学习方法，将预测的靶位点的序列和结构特征整合并建立回归模型，不需要定义种子区亚类。而TargetScan是Lewis等[17]最先开发的用于预测哺乳动物miRNA靶基因的软件，其以靶基因跨物种保守和miRNA-靶基因二聚体热力学特征为基础，并首次引入假阳性率来评价靶基因预测结果。后来，Lewis等[18]对TargetScan进行了优化—TargetScanS，将miRNA种子区修订为5'端第2 ~ 7位碱基，并根据靶位点与miRNA的互补情况，将靶位点分为3种类型：7mer-1A sites、7mer-m8 sites和 8mer sites。

我们进一步通过双荧光素酶报告系统研究发现，miR-106b能够靶向作用于Ngn3 3'UTR抑制Ngn3的表达。qRT-PCR结果表明，随着诱导时间的延长，miR-106b的表达量逐渐降低，与Ngn3的表达量呈负相关，提示miR-106b参与了胰岛素分泌细胞的诱导分化过程，其具体的调节机制及与其他几种重要转录因子的关系还需进一步的研究。

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