抑癌PTEN基因联合p53基因转染对前列腺癌PC-3m细胞凋亡的影响

胡小龙，张春阳，于立春，彭新鑫，高晓霞

辽宁医学院附属第一医院 泌尿外科，辽宁锦州 121001

抑癌基因PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN)在 1997年3月由Li等[1]发现，是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，其在调节细胞增生、凋亡、细胞周期阻滞以及细胞转移和粘连等方面起着重要作用。文献报道，PTEN基因在肝癌，乳腺癌等人类肿瘤中存在不同程度的缺失和突变[2-3]。wt-p53不仅是重要的抑癌基因，而且还是重要的凋亡促进基因。p53及PTEN介导复杂的信号转导途径，与细胞内其他信号系统存在密切联系。近年来研究发现，p53和(或)PTEN基因缺失与膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌的发生发展存在相互关联[4-5]。本文利用脂质体将外源野生型p53基因和PTEN基因联合转染前列腺癌PC-3m细胞，观察其对PC-3m细胞凋亡的影响。

材料和方法

1 主要试剂和仪器 前列腺癌PC-3m细胞株购自American Tissue Culture Collections(ATCC，Manassass，VA，USA)传代培养；携带野生型p53基因、PTEN基因、重组质粒pEGFP-N1-PTEN、pEGFPN1-p53和pEGFP-N1-p53-hPTEN(武汉英骐生物技术有限公司)；脂质体Lipofectamine2000、RPMI 1640培养液和胎牛血清购于Gibco公司；MTT(中国，碧云天)；限制性内切酶EcorI、HindⅢ购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司；鼠抗人PTEN鼠抗人p53单克隆抗体购自SANTA CRUZ公司；引物合成及DNA测序由武汉英骐生物技术有限公司完成；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于凯奇生物科技发展有限公司，流式细胞仪FACSort购自美国Becton Dickson公司。

2 PC-3m细胞培养 PC-3m细胞在37℃、5% CO2饱合适度的细胞培养箱中培养，培养基为含有10%胎牛血清的RPMI 1640，每2 ~ 3 d换液1次，待细胞长满到瓶底80%左右时进行传代，传代至5 ~ 6代，取对数生长期细胞进行转染实验。

3 质粒的转化、培养、提取及基因传染 转染步骤按产品说明书进行：取100 μl感受态大肠埃希菌DH5α，倒入1.5 m l EP管中，冰浴；加入5 μl连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100 ng)冰上15 min；加入300 μl LB培养基(不含抗生素)，37℃，震荡1 h；取上述转化混合液150 μl，分别滴到含抗生素的LB平板培养皿中，挑选蓝白斑菌落进行单克隆培养，采用AxyPrep质粒提取试剂盒按操作说明进行；A组(空白对照组，只含有等量的脂质体)、B组(空载体转染组，含pEGFP-N1空质粒)、C组(含pEGFP-N1-PTEN质粒)、D组(含pEGFP-N1-p53质粒)及E组(含pEGFP-N1-PTEN-p53质粒)，每个实验组分别取用无血清培养基稀释的质粒4 μg和脂质体5 μl混匀后静置5 min，再分别和10 μl Lipofectamine 2000中混合，室温放置20 min，最后加入6孔板中培养，6 h后更换正常培养基，24 h和48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表达情况，并估计转染率。

4 RT-PCR法检测目的基因的表达 萃取总RNA：用0.25%胰酶将每份收集转染后的肿瘤细胞消化后，PBS液洗涤2次，加入1 m l Trizo溶液震荡30 s，加氯仿剧烈震动30 s，室温放置3 min。在4℃条件下离心15 min(12 000 xg)，吸上层无色水相，加等体积异丙醇，4℃、10 min、离心12 000 xg，在管底部可见微量RNA沉淀，弃上清加75%乙醇1 ml，震荡，弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥8 min，沉淀溶于20 μl DEPC水中，在20 μl反应体系中溶入1μg RNA，加入随机引物500 ng，RNAsin 20 U和Mo-MLV反转录酶200 U，在-20℃保存cDNA产物以备用。反应条件为：94℃预变性4 min，94℃变性40 s，57℃退火40 s，72℃延伸40 s，共32个循环，72℃再延伸6 min，将PCR产物分别经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，溴化乙锭染色后在紫外灯下观察电泳结果，并记录摄片。荧光显微镜下观察4组绿色荧光蛋白在前列腺癌PC-3m细胞中表达。p53上游引物为5'-CAGCCAAGTCTGTGACTTGCCGTAC-3'，下游引物为 ：5'-CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC-3'；PTEN上游引物为：5'-CAGCCAAGTCTGTGACTTG CCGTAC-3'，下游引物为：5'-CCGCTCGAGCAGTC GCTGCAACCATCCA-3'。

5 Western blotting法检测P53、PTEN蛋白表达分别瞬时转染上述4组质粒后，收集每组细胞，PBS洗2次，家蛋白裂解液裂解30 min，12 000 r/min 10 min；去上清液，利用Thermo BCA protein assay kit测定蛋白浓度，进行蛋白定量，于12%的SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，并洗膜，加入稀释鼠抗人PTEN、鼠抗人p53单克隆抗体(1∶500)，4℃过夜。洗膜后加入二抗(辣根过氧化物酶标记)，反应1 h(室温)，洗涤3次，将膜取出，等体积BeyoECL显色剂处理后于暗室中曝光、显影、定影成像后扫描分析，结果用蛋白表达强度表示。目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表目的蛋白的相对含量。

6 MTT检测PTEN和p53基因转染PC-3m细胞增殖情况 4组转染后细胞分别计数后以2×104个/ml接种到96孔板内，观察转染后24 h、48 h、72 h、96 h细胞生长情况。培养结束前4 h加入MTT(5 mg/m l) 20 μl/孔，37℃、5% CO2培养4 h后弃除培养基，加入DMSO 150 μl/孔，置摇床上低速振荡10 min使结晶充分溶解后利用酶标仪测定各组的测定OD490值(A)，并以时间为横坐标，各组OD490值(A)平均值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

7 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率PC-3m细胞瞬时转染上述4组质粒后，孵育48 h，70%的冰乙醇固定60 min，再用PBS洗2次后，加 入 200 μl Binding Buffer和 Annexin V-FITC/PI 10 μl，避光室温30 min后加入碘化丙啶(propidium iodide PI)5 μl，避光5 min后快速进行流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

8 统计学处理 所有数据采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，实验数据采用-x±s表示，多组数据间采用多因素的q检验分析，两组数据间采用t检验分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 p53基因和PTEN基因转染后的mRNA表达RT-PCR检测结果示，C组和D组分别有相应PTEN和p53 mRNA的表达，E组中同时存在PTEN和p53 mRNA的表达。见图1。

图 1 RT-PCR检测p53和PTEN m RNA在PC-3m细胞中的表达Fig. 1 RT-PCR showing expression of p53 and PTEN m RNA in PC-3m cellsA：em p ty vector； B: pEGFP-N1 p lasm id； C：pEGFP-N1-PTEN plasm id； D：pEGFP-N1- p53 plasm id； E：pEGFP-N1-p53-PTEN plasm id

2 Western blotting检测转染后PC-3m细胞P53、PTEN蛋白表达 P53蛋白表达提示D、E组明显高于A、 B和C组(P＜0.05)，且E组高于D组(P＜0.05)，见图2；PTEN蛋白表达提示C、E组明显高于A、B 和D组(P＜0.05)，且E组高于C组(P＜0.05)，见图3、表1。

3 荧光显微镜下观察各组重组质粒在前列腺癌PC-3m细胞中表达 在荧光显微镜下观察转染24 h及48 h后A组未见荧光蛋白表达，B、C、D、E组均可见强弱不均的绿色荧光主要集中于细胞质中(48 h效果更好)，但表达强度无明显差异，提示绿色荧光蛋白表达成功，见图4。

4 MTT法检测细胞增殖抑制情况并绘制生长抑制作用曲线 5组转染入PC-3m细胞后，结果发现，第1天5组细胞均处于生长趋势，但C、D、E组均较A、B组生长缓慢，其中C、D组差别不大，E组生长最为缓慢，第2天开始C、D、E组生长均受到不同程度抑制，E组生长抑制最明显，A、B组继续处于生长状态，只是生长的速率较第1天慢。见图5。

5 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测PC-3m细胞系的凋亡率 C、D和E 组细胞凋亡率明显高于A组和B组(P＜0.05)，且E组明显高于C组、D组(P＜0.05)，见图6、表2。

图 2 Western blotting鉴定p53基因蛋白表达情况Fig. 2 Western blot showing expression of p53 gene protein in PC-3m cells

图 3 Western blotting鉴定PTEN基因蛋白表达情况Fig. 3 Western b lot show ing exp ression of PTEN gene protein in PC-3m cells

表1 Western blotting检测转染PC-3m细胞后P53、PTEN蛋白相对于内参的蛋白灰度表达情况Tab. 1 Western blot show ing expression of P53 and PTEN protein in PC-3m cells after transfection(-x±s, n=6)

表2 PTEN、p53基因转染对PC-3m细胞凋亡率影响Tab. 2 Effect of p53 and PTEN gene transfection on apoptosis of PC-3m cells(-x±s, n=6)

讨 论

图 4 荧光显微镜下重组质粒的表达 A：B组； B：C组； C：D组； D:E组Fig. 4 Fluorescence m icroscopy showing exp ression of recombinant p lasm ids A: group B; B: group C; C: group D; D: group E

图 5 PTEN、p53基因转染对PC-3m细胞生长抑制作用情况Fig. 5 Inhibitory effect of PTEN and p53 gene transfection on grow th of PC-3 m cells

图 6 p53和PTEN基因转染对PC-3m细胞凋亡率的影响Fig. 6 Effect of p53 and PTEN gene transfection on apoptosis rate of PC-3m cells

对于前列腺癌患者，传统的治疗方法有手术治疗及放化疗。目前基因靶向治疗已成为研究热点。各种肿瘤发生、发展的基础均是癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活[6]。抑癌基因常因发生突变和缺失改变了其生物学活性而失活。近年来研究表明，抑癌基因PTEN、p53与人类多种肿瘤的增殖、侵袭、转移和诱导细胞凋亡密切相关[7-8]。基于这点，将野生型的抑癌基因转染到肿瘤细胞中，让其在肿瘤细胞中正常表达，恢复细胞的生长表型，从而达到抑制肿瘤细胞增殖、分化、转移的作用。PTEN基因位于染色体10q23.3含有9个外显子，8个内含子，编码由403个氨基酸残基组成的多肽链。PTEN的主要结构功能区含有一个蛋白络氨酸磷酸酶(PTP)的功能区，PTPase络氨酸/丝氨酸/苏氨酸的碱基去磷酸化，从而在多种信号途径和细胞周期中发挥作用。PTEN生物学功能：其转录翻译后的蛋白具有蛋白磷酸酶活性和脂质磷酸酶活性，通过磷脂酰肌醇依赖性激酶(PDK1)作用于丝苏氨酸蛋白激酶(AKt)，诱导细胞程序性死亡。人抑癌基因p53位于17p13.1，由11个外显子和10个内含子组成，编码53 kU的核磷蛋白，具有调控细胞生长，并在基因的稳定性及细胞的衰老中起重要作用。其主要生物学功能：使细胞有丝分裂周期受到阻滞；其表达的蛋白能使肿瘤血管的形成受到抑制；促使肿瘤细胞凋亡[9-10]。在所研究的肿瘤细胞中，PTEN、p53具有较高的突变率，但二者同时发生突变的概率较小。另外，Kim等研究认为，PTEN和p53对抑制鼠前列腺癌细胞增殖、分化、转移和诱导细胞凋亡方面具有互补作用，这种作用具有深刻的分子生物学机制[10-12]。

Rychahou等[13]研究发现，PTEN可抑制PI3K/AKt通路，通过磷脂酰肌醇酶依赖性激酶(PDK1)，作用于丝/苏氨酸蛋白激酶(AKt)逆转PIP2向PIP3的过度转化，诱导细胞程序性死亡。Sawhney等[9,14-17]研究认为，PTEN使FAK上的络氨酸去磷酸化并使P130cas水平下调，从而阻止了FAK/AKt磷酸化，进而抑制了细胞的黏附、浸润、转移和增殖。本实验中也发现，PTEN基因转染PC-3m细胞组的凋亡率及生长抑制情况明显高于空载体转染组和空白对照组，这与以往的研究结论相符。

Stambolic等[18-19]研究证实，PTEN基因上有p53特异性结合元件，在表达(w-t)PTEN的细胞系中，PTEN基因mRNA及蛋白表达可受p53的过表达而受到显著上调。Singh等[19]研究发现，癌基因PIK3CA过表达常伴有p53基因的突变。同时(w-t)p53过表达可以明显抑制PIK3CA的转录，说明p53基因参与了PI3K-PIP3-PKB诱导细胞凋亡途径，这和本研究共转染组蛋白表达强度明显强于单转染组和空转染组结果相符，这种结果的原因可能与PTEN基因和p53基因的相互协同作用于PI3K-PIP3-PKB/AKt通路有关。Mayo等[20]的研究显示，PTEN基因能抑制Mdm2进入核内降解野生型p53，使p53对细胞的生长抑制作用得到有力的保证。我们用Western blotiting检测的结果和上述观点一致，即共转染组P53蛋白表达显著高于单转染p53基因组和空载体转染组。

本组研究结果显示，p53和PTEN基因均可成功诱导前列腺癌PC-3m细胞凋亡，联合转染组较单转染组更能诱导细胞凋亡，差异具有统计学意义。说明两种基因在诱导前列腺癌PC-3m细胞凋亡方面具有相互协同作用，作用机制可能与二者共同作用于细胞PI3K-AKt等信号通路传导及二者细胞周期监控方面具有相互协调作用有关。本研究可为以后更深入探讨两者对信号通路具体作用机制及肿瘤多基因联合靶向治疗提供实验及理论依据。

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