过氧化氢诱导人巨核细胞系Dam i氧化应激模型的建立及评价

汪海涛，林 洁，杨 波，朱宏丽，李素霞，范 辉，郭 搏，冉海红，翟 冰，刘 洋，李宝玲，张文英，李建华，杜 鑫

解放军总医院，北京 100853 1南楼血液科；2生物治疗病区；3老年心内科

氧化应激最早由Sohal等[1]在1985年提出，指机体氧化和抗氧化系统失衡，产生过多的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)或活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)，造成组织损伤或疾病发生[2]。近几年研究发现氧化应激和免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)的关系密切，建立相应的氧化应激细胞模型，对揭示氧化应激在ITP中的作用有着重要意义[3-5]。多篇文献曾用人巨核细胞系Dami建立巨核细胞分化的模型，本研究建立过氧化氢(H2O2)诱导Dami细胞系的氧化应激模型，并从细胞形态学、细胞内活性氧水平及抗氧化应激蛋白的表达3个方面对其进行了评价，为进一步研究氧化应激和巨核细胞分化的关系奠定基础[6-8]。

材料和方法

1 细胞系、试剂与仪器 Dami细胞系，属于人巨核细胞白血病细胞系，由解放军总医院分子免疫室冻存。H2O2(质量分数3%)购自美国Sigma公司；细胞活性检测试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)购自同仁化学研究所；活性氧检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、核因子NF-E2相关因子(Nrf2)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)、血红素加氧酶(HO-1)、醌氧化还原酶(NQO1)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；其余试剂由实验室提供。主要仪器：美国Thermo Forma公司CO2培养箱；德国Eppendorf公司5417R台式离心机、5415R冷冻离心机；北京时代北利离心机有限公司DT5-6甩片机；日本OLYMPUS CK40倒置显微镜、IX71、BX51荧光显微镜；美国Bio-Rad公司SDS-PAGE电泳仪、酶联检测仪；美国BD公司流式细胞仪等。

2 细胞培养与实验分组 Dami以1×106个/ml浓度接种于含10%胎牛血清、100 U/m l青霉素和100 μg/m l链霉素的RPMI1640培养基中， 37℃、 5%CO2培养。Dami细胞悬浮抱团生长，每2 d传代1次，取对数生长期的细胞进行实验。设实验组、对照组。实验组加入不同浓度的H2O2，对照组加入等体积的RPMI1640培养基。

3 Dami细胞形态学观察 H2O2刺激24 h后，倒置显微镜观察Dami细胞形态；浓度调至1×106个/ml，400 g离心力甩片，晾干后滴加适量Giemsa染液，30 min后清水小心冲洗干净，自然风干，显微镜下观察。

4 CCK-8试剂盒检测Dami细胞增殖活性 将Dami细胞以2×105/孔接种于96孔板，实验组分别用终浓度为3.2 mmol/L、1.6 mmol/L、0.8 mmol/L、0.4 mmol/L、0.2 mmol/L、0.1 mmol/L、0.05 mmol/L、0.025 mmol/L、 0.012 5 mmol/L的H2O2处理，每组设3个复孔；对照组加入等体积RPMI1640培养基；37℃、5% CO2孵育2 h后，每孔加10 μl CCK-8，继续孵育2 h，酶联检测仪测定各孔在450 nm波长的吸光度值。重复3次实验，计算出H2O2对Dami细胞的半数抑制浓度(half-inhibitory concentration，IC50)，用于后续实验。

5 流式细胞仪检测Dami细胞氧化应激水平 Dami细胞浓度调至2×106/ml，以1.5 ml/管转移至5个EP管，无血清培养基洗2次，以1∶1 000体积比加载DCFH-DA探针，37℃、5% CO2孵育20 min，每5 min摇匀1次；无血清培养基洗3遍，实验组分别加入终浓度为10 mmol/L、1 mmol/L、0.1 mmol/L的H2O2，裸细胞(不加载探针，无H2O2刺激)和阴性对照组(加载探针，无H2O2刺激)加入等体积无血清培养基，37℃、5% CO2孵育2 h；无血清培养基洗1遍，300 μl PBS重悬，流式细胞仪检测。

6 Western blot检测H2O2刺激前后抗氧化应激蛋白的表达 Dami细胞调至2×106个/m l，以2 m l/孔接种于6孔板，分别加入终浓度为10 mmol/L、1 mmol/L、0.1 mmol/L的H2O2，对照组加入等体积含10%胎牛血清的培养基，37℃、5% CO2孵育24 h，提取细胞总蛋白，煮沸变性后进行蛋白定量，取等量总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，60 V条件下NC膜转膜3 h；5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST洗1次，分别与Nrf2、GCLC、HO-1、NQO1、GAPDH一抗4℃反应过夜；TBST洗3次，加相应二抗，室温旋转反应1 h，TBST洗3次，ECL发光检测，X线片显影，扫描图像。

7 统计学分析 使用SPSS13.0软件，计量资料用-x±s表示，两组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，P＜0.01为差异有统计学意义。IC50计算使用Graphpad prism5.0软件。流式结果使用WinMDI2.8软件分析。

结 果

1 H2O2对Dami细胞形态学影响 对照组见Dami细胞抱团生长，形态饱满，折光性强；0.1 mmol/L H2O2处理组偶见细胞皱缩，细胞仍呈抱团生长；1 mmol/L H2O2处理组细胞折光性变差，部分细胞皱缩；10 mmol/L H2O2处理组细胞皱缩明显，细胞膜不完整，边界不清(图1)。Giemsa染色见对照组胞核染色呈均匀紫红色； 0.1 mmol/L H2O2处理组偶见细胞核不规则；1 mmol/L H2O2处理组细胞核着色变浅，细胞核不规则程度增加，可见核碎裂；10 mmol/L H2O2处理组细胞固缩，细胞整体染成深蓝色。

2 H2O2对Dami细胞增殖活性的影响 CCK-8法检测不同浓度H2O2处理前后细胞增殖水平显示，H2O2浓度在0.8 ~ 1.6 mmol/L时，实验组OD值较对照组明显下降(P＜0.01，图2A)。3次实验得出的H2O2对Dami细胞增殖IC50分别为：0.827 mmol/L、1.026 mmol/L、0.887 mmol/L，平均(0.9132±0.144) mmol/L(图2B)，最终采用1 mmol/L H2O2作为实验浓度。

图 1 不同浓度H2O2分别处理24 h后Dam i细胞形态学变化(×100) A： 相应H2O2浓度下活细胞形态； B： Giemsa染色Fig. 1 M orphology of Dam i cells 24 h after treated w ith H2O2 at different concentrations (×100) A：M orphology of live cells；B：Giem sa staining

3 不同浓度H2O2诱导Dami细胞产生氧化应激水平 分别用0.1 mmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L H2O2对Dami细胞处理2 h，流式细胞仪检测各组Dami细胞氧化应激的阳性率分别为12.11%、20.91%、52.53%；Mean值分别为303.20、352.36、550.76(图3)。使用WinMDI2.8软件将各浓度组叠加发现各实验组和阴性对照存在差异(图3F)。

4 Western blot检 测 H2O2刺 激 前 后 Nrf2、GCLC、HO-1、NQO1的变化 H2O2处理24 h后，10 mmol/L处理组细胞存活率低，收集细胞量少，仅对0.1 mmol/L、1 mmol/L处理组进行Western blot检测。在GAPDH内参一致情况下，和对照组相比，0.1 mmol/L、1 mmol/L处理组Dami细胞抗氧化应激相关的蛋白Nrf2、GCLC表达量升高(图4)，而HO-1、NQO1在对照组和实验组均未见表达。

图 4 Western b lot检测不同浓度H 2O 2刺激下Dam i细胞Nr f2和GCLC的变化Fig. 4 Western b lot show ing Nrf2 and GCLC exp ression in Dam i cells treated w ith H2O2 at different concentrations

讨 论

氧化应激在系统性红斑狼疮、酒精性肝病、糖尿病等多种免疫相关性疾病中起重要作用[9]。近几年研究发现，氧化应激也参与了免疫性血小板减少症的发生发展，高水平的氧化应激预示着进展为慢性ITP的可能[3-5]。众所周知，血小板破坏增多和巨核细胞分化成熟障碍、血小板生成减少共同参与了ITP的发病，建立巨核细胞的氧化应激模型对研究氧化应激与巨核细胞分化成熟的关系显得很有必要。

Dami细胞系来源于人巨核细胞白血病，细胞表面高表达血小板CD41a(GpⅡb/Ⅲa)、CD61(GpⅢa)抗原，具有巨核细胞多倍体生长的特性，佛波酯、血小板生成素、 IL-11等可刺激其增殖分化[6-7]；Lev等[8]曾用Dami细胞建立巨核细胞体外分化模型，并证明它能产生有功能的血小板，可见Dami细胞是研究巨核细胞分化成熟较为理想的细胞模型。H2O2容易获得，性质相对稳定，使H2O2诱导的氧化应激模型应用最为广泛[10]。H2O2极易透过细胞膜，产生活性氧自由基，引起脂质、蛋白、DNA等细胞成分损伤，并产生大量代谢产物，包括胸腺嘧啶乙二醇、丙二醛、蛋白羰基衍生物等氧化产物，这些产物的水平能代表细胞的氧化应激状态[11]。本实验采用DCFH-DA探针法检测H2O2诱导的氧化应激。DCFH-DA对活性氧非常敏感，它本身不带荧光，但能被细胞内酯酶水解成DCFH，DCFH可被ROS氧化为带有强烈荧光的DCF，用流式细胞仪检测荧光强度可反映细胞内ROS生成的量，代表氧化应激的程度。本实验发现随着H2O2浓度的升高，细胞内活性氧水平逐渐增强，氧化应激造模成功，但在10 mmol/L H2O2刺激下，Dami细胞形态学及细胞增殖实验发现，细胞存活率过低(图1、图2)，不适合后续实验，而H2O2对Dami细胞的半最大效应浓度(EC50)也在1 mmol/L左右，所以本实验采取1 mmol/L H2O2作为后续实验浓度。

有关细胞抗氧化应激的机制，研究最多的是keap1-Nrf2/ARE信号通路。Nrf2是抗氧化反应元件 (antioxidant responsive element，ARE)的激活因子。生理状态下，Nrf2和keap1结合被锚定于细胞质，当受到亲电子基团或ROS刺激时，Nrf2和keap1解偶联进入细胞核，与细胞核中的小Maf蛋白聚合成异二聚体，并结合于ARE上，启动下游保护性基因，包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、醌氧化还原酶、血红素加氧酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位等的转录，提高细胞的抗氧化能力[12-13]。本实验用Western blot检测H2O2刺激 Dami细胞 24 h后Nrf2、GCLC、HO-1、NQO1的变化，结果显示Nrf2、GCLC表达量较对照组升高，但多次实验均没有检测到HO-1和NQO1的表达，可能是Dami细胞不表达这两种酶，但需要用实时定量PCR方法从基因水平进一步验证。

总之，Dami细胞氧化应激模型的建立，为研究氧化应激对巨核细胞分化成熟的影响提供了工具，为抗氧化药物的开发和筛选奠定了基础。我们将选用临床上常用的抗氧化应激药物，研究它们对氧化应激状态下Dami细胞的增殖、分化的影响，并进一步研究其分子机制。

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