提高CpG ODN 免疫效价方法的研究进展

王 旋 王树平 丁子清 申玉芹 于海蛟 周 岳 林崇韬

(吉林大学口腔医学院牙周病科，吉林 长春 130021)

1995年Krieg 等〔1〕研究发现CpG二寡聚核苷酸(ODN)是病原体 DNA 免疫刺激活性的基础结构并等将这类含有非甲基化CpG的特定结构称为CpG 基序，也有学者称其为免疫刺激序列。其中，组成CpG ODN胞嘧啶的第五位碳原子必须是非甲基化的，正是因为这种结构，使CpG ODN 具有免疫刺激活性作用,换言之，这也是CpG ODN 免疫刺激活性的核心结构。具有这种结构的CpG ODN能被Toll样受体(TLR9)特异性识别，通过TLR9的识别作用启动信号转导级联反应。由CpG ODN引起的免疫刺激活性作用是明显且多样化的，其主要作用包括：(1)直接刺激浆细胞样树突细胞(pDCs)：通过促进pDCs成熟并使其分泌大量的IL-12 、细胞共刺激分子CD86及少量的肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6。但是，Chen等〔2〕研究发现：长期给予树突状细胞CpG ODN刺激能抑制其成熟。Tu等〔3〕研究证实，应用抗CD81单克隆抗体作用于CpG ODN诱导的人肝内pDCs，可以抑制pDCs成熟、分化，抑制pDCs分泌 TNF-α及负向调节CD80、CD86的表达。(2)直接刺激B细胞：与外界或宿主双链DNA引起的B细胞免疫应答不同，治疗应用的单链CpG ODN能促进B细胞的分裂增殖，促使其分泌IL-6、CD86〔4〕。(3)间接激活NK 细胞和T细胞，调控Th1/Th2免疫应答和增强血液循环系统中补体的活化等〔5〕。

由于TLR9识别CpG ODN后，能诱导天然免疫应答和获得性免疫应答，因此CpG ODN在感染性疾病〔6〕、过敏性疾病〔7〕、癌症〔8〕的治疗中有广泛的应用前景。因此，多种多样的CpG ODN被研究设计。但是，由于游离的CpG ODN进入机体后存在许多缺陷，如在体内存在时的不稳定性、毒性、不理想的药物动力代谢和缺乏靶细胞特异性且细胞摄取率低，使其临床应用仍然面临许多障碍。因此，一些学者尝试通过改良CpG ODN的骨架结构或者使用递呈载体来克服上述障碍，该文就这些学者在这两方面的研究进展作一综合分析。

1 CpG ODN改良骨架结构及其免疫刺激活性的影响

1.1骨架的长度 实验研究表明，含CpG 基序但碱基数目少于8个的ODN不存在活性。只有当骨架之中含有18～25个碱基且含有非甲基化的CpG基序时，ODN才可以较好地发挥其免疫刺激活性作用。

1.2骨架的化学修饰

1.2.1骨架的硫代化修饰 硫代化修饰是寡聚脱氧核苷酸骨架修饰中最常见、应用最广泛的化学修饰,把磷酸二酯骨架中一个非桥联氧原子用硫原子取代的过程。因为磷酸硫代化修饰的ODN可抵抗体内核酸酶的消化作用〔9〕,这将有利于ODN在体内稳定存在，此外还可以增加细胞对ODN的摄取率,从而提高其免疫效价。研究证实〔10〕,当硫代磷酸酯骨架CpG ODN(PS-ODN)的浓度仅为磷酸二酯骨架CpG ODN (PO-ODN)的1/10～1/100 h，即可表现出相当强度的免疫刺激活性,如诱导NO分泌、TNF-α生成、活化IL-12启动子等。而且，骨架全部被硫代化修饰较骨架部分被修饰的CpG ODN表现出更强的免疫刺激活性作用。到目前为止，临床试验所使用的CpG ODN，如ODN 2216,ODN 2006,ODN 2395均为PS-ODN。

国内外多篇文献报道〔11〕，PS-ODN可能引起严重的短期或长期副作用。研究发现，将PS-ODN注射于小鼠膝关节内，可引起小鼠以单核细胞聚集和TNF-α高表达为特征的膝关节炎；将PS-ODN通过静脉注射于猕猴体内，可使其体内补体过度激活从而引起急性中毒等。研究表明，PS-ODN所引起的毒副作用是由于被修饰的骨架与非特异性的聚阴离子及血清蛋白混杂结合引起的，与CpG基序不存在依赖关系。

1.2.2天然骨架的模拟 PO-ODN能较真实的模拟天然CpG ODN与TLR9相互作用〔12〕。PO-ODN发挥的免疫刺激活性作用与PS-ODN比较，存在显著差异。PO-ODN作用存在于外周血单核细胞和B细胞中TLR9时产生IL-6引起的免疫反应与CpG基序呈依赖性，而PS-ODN诱导产生IL-6则呈CpG基序非依赖性〔13〕。同时，Meng等〔15〕发现PO-ODN高浓度时不存在免疫抑制效应，而PS-ODN在较高的浓度时却表现出一定的免疫抑制效应。此外，CpG 基序远中序列的微小变化能引起PS-ODN免疫刺激活性的改变，但此种微小序列变化对PO-ODN免疫刺激活性没有影响。Roberts等〔14〕研究表明，在ODN末端增加脱氧鸟苷残基时，通过延迟MAPK信号转导可使PS-ODN免疫刺激活性降低，但是这种改变对PO-ODN的免疫刺激活性完全没有影响。虽然，PO-ODN与PS-ODN相比存在诸多优势，但是体内及体外实验〔15〕均证实，在血浆溶液中，PO-ODN由于核酸外切酶的作用可被快速降解，导致其不能激活TLR9而产生强烈的免疫反应，因此PO-ODN的应用仍然受到限制。

1.2.3骨架的立体化学修饰 近些年许多学者致力于研究CpG ODN 的立体化学修饰。由于ODN的降解主要由核酸外切酶作用完成，因此使仅含磷酸二酯骨架结构的ODN成为类似质粒的环状结构可免受降解这一观点得到了大家广泛的认可。有研究表明，由3条简单ODN链自然形成的Y型ODN(Y-ODN)可在免疫作用被激活时产生TNF-α和IL-6,同时这种结构可提高细胞的摄取率，但是不能抵抗核酸酶的降解作用。Rattanakiat等〔16〕设计出树枝状DNA(DL-DNA)，此种设计是通过将Y-DNA与CpG基序相耦合形成，由于此种类型可有效抵抗核酸酶的降解，因此可有效提高免疫效价。Nishikawa等〔17〕通过实验证明，包含CpG基序和完全由磷酸二酯骨架构成的X型CpG ODN(X-ODN)可以刺激RAW 264.7细胞，抵抗核酸酶降解的同时，在8 h内可持续诱导TNF-α的释放，说明X-ODN具有较强的免疫刺激活性。Li等〔18〕合成四面体结构的CpG ODN，能在血浆中稳定保持8 h以上而不被降解，当被巨噬细胞样细胞高效摄取后，可通过TLR9识别激活诱导细胞产生大量TNF-α、IL-6等因子。

目前更多学者在设计具有免疫刺激活性的CpG ODN时，倾向于既能保障CpG ODN不被核酸外切酶快速降解，同时又可以提高细胞的摄取率，因此尽可能设计为PO-ODN来获得最佳治疗效果同时使毒副作用降到最低。

2 递呈载体对CpG ODN免疫刺激活性的影响

游离的CpG ODN在机体内易被核酸外切酶快速降解，而且细胞对其摄取率较低，因此大大降低了其免疫效价。基于此，为了避免CpG ODN被快速降解，使其顺利到达靶细胞，同时促进细胞的摄取，许多学者将CpG ODN进行了一些预处理。通常情况，可以通过与其他佐剂共同使用来提高CpG 佐剂活性〔19〕。微生物病原体引起的免疫应答较CpG ODN更强烈，可能是因为微生物病原体表达多种PRRs，从而在一定时间范围内可以同时或者有序的活化多种TLRs以及其他识别受体。因此，一些学者尝试联合使用多种TLR激活剂来增强CpG ODN免疫应答从而获得更强的抗感染能力。除此之外,递呈载体技术的应用，不仅解决了体内降解的问题，而且还有效提高了细胞对CpG ODN的摄取率。

2.1阳离子脂质体递呈载体 脂质体是一种临床应用较早且发展最为成熟的一类靶向药物载体，具有安全、缓释和可生物降解等特点。作为载体的脂质体可以单独递呈CpG ODN，也可以在保证佐剂CpG ODN与抗原亲和性不变的情况下同时递呈两者。脂质体能直接将CpG ODN运送至靶细胞，增加CpG ODN的提呈效率，同时通过改善药物代谢动力学及生物学分布，来降低毒性，增加安全性。含CpG ODN的脂质体微粒经淋巴、皮肤、皮下注射和滴鼻4种途径进入体内时，IgG2a滴度及递呈细胞摄取率都有不同程度提高，说明含CpG ODN的脂质体微粒有广泛的适用范围〔20〕。此外，经大量动物实验研究证实，以脂质体作为递呈载体的CpG ODN免疫刺激活性和免疫预防及治疗效果均有明显提升。Puangpetch等〔21〕将CpG ODN包裹于阳离子脂质体中，免疫作用雄性BALB/c 小鼠，同时用类鼻疽杆菌感染小鼠，实验结果显示,脂质体包裹组与裸CpG ODN组小鼠相比，能够产生更好的免疫保护力，30 d内的抗感染率高达100%，死亡率明显下降。Golali等〔22〕运用脂质膜预备方法将CpG ODN和可溶的利什曼原虫抗原包裹于脂质体中，免疫作用BALB/c 小鼠，攻毒试验结果显示，脂质体包裹组小鼠IgG2a/IgG1 、IgG的表达明显提高，同时诱导产生了高水平的干扰素(IFN)-γ、IL-4。

2.2阳离子聚合物递呈载体 阳离子聚合物也可以作为CpG ODN递呈载体，如：壳聚糖、聚乙交脂丙交酯(PLG)聚合物等，他们通过正负电荷吸引结合使含CpG ODN的颗粒体积变小,从而不被核酸酶降解，进而增强ODN作为免疫佐剂的免疫应答作用〔23〕。在小鼠实验中，壳糖体聚合物作为递呈载体包裹猪IL-6基因和CpG ODN可有效提高CpG ODN的免疫刺激活性。众所周知，PLG具有良好的生物相容性和生物可降解性。破伤风类毒素与CpG ODN通过PLG纳米颗粒共传递可使CpG ODN佐剂用量明显减少，从而可以减小由于佐剂用量较大而引起毒副作用的可能性。小鼠实验研究也表明，用阳离子PLG聚合物包裹的猪副伤寒疫苗和CpG ODN同研究中的对照组比较，被包裹组显示出更强的免疫刺激效应。

2.3纳米级颗粒递呈载体 研究表明，pDCs和吞噬细胞可通过吞噬或内吞作用摄取纳米至微米级的颗粒，因此，除了研究将脂质体或阳离子聚合物作为递呈系统外，许多学者将研究对象转移到纳米级颗粒上。CpG ODN可以与亲脂性分子-胆固醇在水溶液中凝集结合形成胆固醇-CpG ODN(Chol-CpG ODN)纳米级颗粒，这样可增加CpG ODN在血清中的稳定性〔24〕。同时，Chol-CpG ODN能与脂性蛋白如：脂蛋白受体、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、跨膜蛋白等相结合，通过这种结合改变Chol-CpG ODN在组织中的转运与分布。进而，可将Chol-CpG ODN纳米级颗粒强有力且准确地运送至靶细胞，同时，借助pDCs与吞噬细胞的吞噬或内吞作用提高对其的摄取率。除此之外，与胆固醇结合形成的纳米级CpG ODN增加了其自身的免疫刺激活性。因此，借助纳米级颗粒可有效提高CpG ODN的免疫效价。

CpG ODN 与递呈载体联合应用的优势：(1)保护其不被内核酸酶快速降解；(2)延长其在体内的停留时间；(3)提高细胞对其的摄取率，间接使其应用剂量减少，降低可能产生的毒副作用；(4)可准确地将其运送至靶器官；(5)形成缓释作用，即通过缓慢释放CpG ODN，延长其在体内作用时间；(6)保证其与抗原被同一靶细胞同时摄取，提高免疫刺激活性。鉴于CpG ODN与递呈载体联合应用的优势，对递呈载体的研究仍然不断在发展与完善，开发出更适合CpG OND临床应用的递呈载体系统，对提高CpG OND免疫刺激活性和增加机体免疫效应，从而使机体更快产生抗体具有深远意义。

3 小 结

综上所述，由于CpG ODN通过激活TLR9诱导产生天然免疫和获得性免疫，因此其在感染性疾病、过敏性疾病、癌症的治疗中有广泛的应用前景。在改良骨架方面，对于PO-ODN的研究远不及PS-ODN，但是从提高和保持系统免疫活性的角度观察，PO-ODN较PS-ODN更有优势。对于递呈系统的构建，随着材料学的不断发展，CpG ODN递呈系统会有更大的改善与提高，在保证安全性的前提下，CpG ODN免疫效价会有更显著地提高。

4 参考文献

1Krieg AM,Yi AK,Matson S,etal. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation〔J〕.Nature,1995；374(6522):546-9.

2Chen J,Deng C,Shi Q,etal. CpG oligodeoxynucleotide induces bone marrow precursor cells into myeloid-derived suppressor cells〔J〕. Mol Med Report,2013；8(4):1149-54.

3Tu Z,Zhang P,Li H,etal. Cross-linking of CD81 by HCV-E2 protein inhibits human intrahepatic plasmacytoid dendritic cells response to CpG-ODN〔J〕. Cell Immunol,2013；284(1-2)：98-103.

4Roberts TL,Turner ML,Dunn JA,etal. B cells do not take up bacterial DNA: an essential role for antigen in exposure of DNA to toll-like receptor-9〔J〕. Immunol Cell Biol,2011；89(4): 517-25.

5Harikrishnan R,Balasundaram C,Heo MS. Poly d,l-lactide-co-glycolic acid-liposome encapsulated ODN on innate immunity in Epinephelus bruneus against Vibrio alginolyticus 〔J〕. Vet Immunol Immunopathol,2012；147(1): 77-85.

6Klinman DM,Klaschik S,Sato T,etal. CpG oligonucleotides as adjuvants for vaccines targeting infectious diseases〔J〕.Adv Drug Deliv Rev ,2009；61(3): 248-55.

7Vadasz Z,Toubi E. Semaphorin 3A-a marker for disease activity and a potential putative disease-modifying treatment in systemic lupus erythematosus〔J〕. Lupus,2012；21(12): 1266-70.

8Holtick U,Scheulen ME,von Bergwelt-Baildon MS，etal. Toll-like receptor 9 agonists as cancer therapeutics〔J〕. Expert Opin Inv Estig Drug,2011；20(3): 361-72.

9Krieg AM. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation〔J〕.Nat Rev Drug Discov,2006；5(6):471-84.

10Seser DP,Naik S,Besley SJ,etal. Phosphorothioate backbone modification modulates macrpage activation bu CpG DNA〔J〕.J Immunol,2000；165(8):4165-73.

11Kim D,Rhee JW,Kwon S,etal．Immunostimulation and anti-DNA antibody production by backbone modified CpG-DNA 〔J〕. Biochem Biophy Res Commun,2009；397(2):362-7.

12Yasuda K,Rutz M,Schlatter B,etal. CpG motif‐independent activation of TLR9 upon endosomal translocation of "natural" phosphodiester DNA〔J〕. Eur J Immunol,2006;36(2): 431-6.

13Suwarti S,Yamazaki T,Svetlana C,etal. Recognition of CpG oligodeoxynucleotides by human Toll-like receptor 9 and subsequent cytokine induction 〔J〕. Biochem Biophys Res Commun,2013；430(4):1234-9.

14Roberts TL,Dunn JA,Sweet MJ,etal. The immunostimulatory activity of phosphorothioate CpG oligonucleotides is affected by distal sequence changes 〔J〕. Mol Immunol,2011；48(8):1027-34.

15Meng W,Yamazaki T,Nishida Y,etal. Nuclease-resistant immunostimulatory phosphodiester CpG oligodeoxynucleotides as human Toll-like receptor 9 agonists〔J〕. BMC Biotechnol,2011；11(1): 88.

16Rattanakiat S,Nishikawa M,Funabashi H,etal.The assembly of a short linear natural cytosine-phosphate-guanine DNA into dendritic structures and its effect on immunostimulatory activity〔J〕. Biomaterials,2009；30(29): 5701-6.

17Nishikawa M,Mizuno Y,Mohri K,etal. Biodegradable CpG DNA hydrogels for sustained delivery of doxorubicin and immunostimulatory signals in tumor-bearing mice〔J〕. Biomaterials ,2011；32(2):488-94.

18Li J,Pei H,Zhu B,etal. Self-assembled multivalent DNA nanostructures for noninvasive intracellular delivery of immunostimulatory CpG oligonucleotides〔J〕.ACS Nano,2011；5(11):8783-9.

19Mutwiri G,van Drunen Littel-van den Hurk S,Babiuk LA. Approaches to enhancing immune responses stimulated by CpG oligodeoxynucleotides〔J〕. Adv Drug Deliver Rev,2009；61(3): 226-32.

20Wilson KD,de Jong SD,Tam YK. Lipid-based delivery of CpG oligonucleotides enhances immunotherapeutic efficacy〔J〕.Adv Drug Deliver Rev,2009；61: 233-42.

21Puangpetch A,Anderson R,Huang YY,etal. Cationic liposomes extend the immunostimulatory effect of CpG oligodeoxynucleotide against Burkholderia pseudomallei Infection in BALB/c Mice〔J〕.Clin Vaccine Immunol,2012；19(5):675-83.

22Golali E,Jaafari MR,Khamesipour A,etal. Comparison of in vivo adjuvanticity of liposomal PO CpG ODN with Liposomal PS CpG ODN: soluble leishmania antigens as a model〔J〕.Iran J Basic Med Sci,2012；15(5):1032-45.

23Chen S,Zhang H,Chinnathambi S,etal. Synthesis of novel chitosan-silica/CpG oligodeoxynucleotide nanohybrids with enhanced delivery efficiency〔J〕. Mater Sci Eng Mater Biol Appl,2013；33(6): 3382-8.

24Rattanakiat S,Nishikawa M,Takakura Y.Self-assembling CpG DNA nanoparticles for efficient antigen delivery and immunostimulation〔J〕. Eur J Pharm Sci,2012；47(22): 352-8.