外源性促红细胞生成素对大鼠肺缺血再灌注组织AQP 1表达的影响

朱登彦 张 岩 李向楠 赵 佳 赵 松

(郑州大学第一附属医院胸外科,河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州大学肿瘤分子外科研究所 郑州市胸部肿瘤重点实验室，河南 郑州 450052)

促红细胞生成素(EPO)是一种调节红细胞生成的糖蛋白类激素，其基本生理功能是刺激骨髓红细胞的生成和释放。目前临床上主要用EPO治疗肾性贫血及肿瘤等各种慢性疾患所伴发的贫血。近年来的研究发现，EPO对肺缺血再灌注具有保护作用〔1〕。水通道蛋白(AQPs)是一组可调节水分子进出细胞膜的同源蛋白质，AQP 1的异常表达是肺缺血再灌注损伤的原因之一〔2〕。本实验研究外源性EPO对大鼠肺缺血再灌注损伤后AQP 1表达的影响。

1 材料与方法

1.1动物及主要试剂 60只河南省实验动物中心提供的SPF级健康Wistar大鼠，雌雄不限，体重250～300 g。重组人EPO(rhEPO，江苏宏泰生物工程制品厂)，戊巴比妥钠注射液(上海剂三厂)、抗AQP 1多克隆抗体购自Santa Cruz公司，聚合酶链反应(PCR)引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。Trizol试剂购自Invitrogen公司，AMV第1链合成试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司，PCR试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2动物模型建立 3%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉后，尾静脉注射肝素(100 U/kg)。仰卧位固定，气管切开后插管，接动物呼吸机行机械通气(吸入室内空气，呼吸频率60次/min，潮气量单侧肺通气8～10 ml/kg，双侧肺通气15～20 ml/kg，吸呼比为1∶2)，经胸骨右缘第3～5肋间开胸，离断右肺下韧带，游离右肺门，下穿手术线，于呼气末结扎右肺门(右主支气管，右肺动、静脉)，夹闭45 min后开放120 min，制成在体肺缺血再灌注模型。

1.3实验分组 60只大鼠随机分为三组，每组20只。假手术组：开胸游离右肺门，无其他特殊处理。缺血再灌注组:开胸游离右肺门后，夹闭肺门阻断45 min，再灌注120 min。EPO干预组:于术前2 h腹腔注射rhEPO(5000U/kg)〔3〕，余处理同缺血再灌注组。各组于再灌注120 min时采集标本。

1.4检测指标 取部分右肺组织，滤纸吸干表面水分，测湿重，然后置70℃热风烘干箱烘干至恒重后测干重，肺水含量=(肺湿质量-肺干质量)/肺湿质量。取右肺中叶约1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小组织块，用10%甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肺组织病理学变化。余右肺组织剪切成黄豆大小的块并迅速放入液氮罐，然后转入-80℃冰箱保存，采用RT-PCR方法检测肺组织中AQP 1 mRNA，采用免疫印迹方法测肺组织AQP 1蛋白。

1.5大鼠肺组织中AQP 1蛋白的检测 用蛋白裂解液提取组织蛋白质，用考马斯亮蓝标准曲线法测定蛋白质浓度。制备十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量50 μg，常规电泳、转膜、封闭，加入按1∶200稀释的一抗，4℃下孵育过夜，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释度为1∶10 000)，置于37℃下孵育1 h，以增强型化学发光试剂(ECL)处理后，在暗室内曝光X线胶片，图像用Total Lab软件(2.0版)进行灰度分析。

1.6大鼠肺组织中AQP 1 mRNA表达的检测 取肺组织，应用Trizol试剂提取肺组织总RNA。取总RNA 2 μg，行逆转录。PCR扩增AQP 1，以β-actin为内参，每个样本重复3次。AQP 1的上游引物为5'-TCCTGCGAGCCGTCCTGTA-3'，下游引物为5'-GGTTGTTGAAGTTGTGGGTGAG-3'，长度为354 bp。PCR反应条件为：以94℃预变性5 min、94℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃延伸1 min为1个循环，共计28个循环，再72℃延伸5 min，最后降至4℃结束反应。PCR产物在10 g/L琼脂糖凝胶中电泳，采用凝胶成像系统记录分析，结果以相对吸光度值(A值)表示。

2 结 果

2.1大鼠肺组织AQP 1 mRNA及AQP 1蛋白的表达 AQP 1 mRNA在三组肺组织的平均相对A值分别为 0.80±0.04、0.49±0.02、1.1±0.02;免疫印迹三组肺组织AQP 1蛋白表达的相对灰度分别为0.45±0.03、0.30±0.04、0.57±0.02。AQP 1 mRNA及蛋白表达水平再灌注组较假手术组降低，干预组较再灌注组、假手术组增高(P<0.05)。

2.2大鼠肺肺水含量比较 肺水含量假手术、再灌注、干预组分别为0.65±0.03、0.93±0.02、0.74±0.04。再灌注组、干预组较假手术组增高，干预组较再灌注组低(P<0.05)。

2.3镜下病理 假手术组肺泡腔完整，肺泡间隔均匀一致，无明显充血、水肿。再灌注组肺间质毛细血管充血，肺泡间隔明显增厚，肺泡腔内可见血细胞渗出及渗液积聚。干预组肺泡壁略厚，间质毛细血管充血程度降低，肺泡腔出血、渗出程度与再灌注组比较明显减轻。

3 讨 论

肺缺血再灌注损伤是一个比较常见及重要的病理生理过程，指肺组织经历一定时间的缺血后再给予恢复血供，缺血性损伤没有减轻反而加重的病理现象。临床主要表现为逐渐加重的低氧血症、肺顺应性进行性下降及肺间质水肿等。AQPs 是一组与水通透性有关的同源蛋白质大家族的总称，AQPs 通过肺泡上皮促进水转运，无论生理或病理状态下均对呼吸系统的水平衡起到重要作用〔4〕。研究发现，大鼠肺组织AQP l 主要表达在肺毛细血管内皮细胞，在大鼠肺缺血再灌注损伤过程中，AQP 1 蛋白及mRNA 表达显著下降，提示肺水肿的形成与AQP 1表达降低有关〔2〕。

EPO是一种主要由肾脏分泌的刺激骨髓造血的糖蛋白类激素，临床主要应用于治疗贫血。随着研究的深入，其广泛的细胞保护作用也日益得到关注。在心脏和肾脏的缺血再灌注损伤中，EPO 表现出很强的器官保护作用〔5〕。国内外研究显示：EPO 主要通过与细胞膜上EPO受体结合，激活胞质内受体相关的蛋白酪氨酸激酶，引起EPO受体胞内段酪氨酸残基磷酸化及胞质内一系列蛋白激酶的游走和活化，通过激活多条信号转导机制，从而发挥器官保护作用〔6〕。

本研究发现大鼠缺血再灌注后肺组织的肺水含量增大，同时AQP 1的表达量较正常组织下降，出现明显的肺水肿，说明AQP 1的表达减少与肺水肿的形成有关，AQP 1参与了大鼠肺缺血再灌注损伤水平衡的调节。外源性EPO使大鼠AQP 1 mRNA及蛋白表达水平较缺血再灌注组增加，肺水含量下降，肺水肿减轻，提示给予外源性EPO可通过增加AQP 1的表达，促进增多的水肿液回流入血管系统，从而减轻肺水肿，对大鼠肺缺血再灌注损伤起到保护作用。

4 参考文献

1Moeini M,Nematbakhsh M,Fazilati M,etal. Protective role of recombinant human erythropoietin in kidney and lung injury following renal bilateral ischemia-reperfusion in rat model〔J〕. Int J Prev Med,2013;4(6): 648-55.

2Li XN,Yang JY,Pan X,etal. Influence of extract of Ginkgo biloba leaves tablets on the aquaporin-1 expression in isolated lung ischemia reperfusion〔J〕. Chin Med J,2013;126(24): 4720-3.

3Wu H,Ren B,Zhu J,etal. Pretreatment with recombined human erythropoietin attenuates ischemia-reperfusion-induced lung injury in rats〔J〕. Eur J Cardiothorac Surg,2006;29(6): 902-7.

4Perez Di Giorgio J,Soto G,Alleva K,etal.Prediction of aquaporin function by integrating evolutionary and functional analyses〔J〕. J Membr Biol,2014;247(2): 107-25.

5Li XJ,Zhang GX,Sun N,etal.Protective effects of erythropoietin on endotoxin-related organ injury in rats〔J〕. J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci,2013;33(5):680-6.

6Miyake M,Goodison S,Lawton A,etal. Erythropoietin is a JAK2 and ERK1/2 effector that can promote renal tumor cell proliferation under hypoxic conditions〔J〕. J Hematol Oncol,2013;6(1):65.