腺瘤样结肠息肉易感基因蛋白截短与大肠腺瘤及大肠癌早期诊断关系

杨 春 杨 宝 李 恒 樊海燕 杨银学

(宁夏医科大学总医院结直肠外科，宁夏 银川 750001)

大肠癌发病隐匿，早期没有明显症状，患者就诊时已经处于晚期，失去了治疗的最佳时机，早期大肠癌手术患者5年生存率可达90%以上，晚期手术伴有转移的患者5年生存率不足10%〔1〕。大肠癌发生涉及多基因、多步骤的分子病理改变过程，癌基因激活、抑癌基因失活是大肠癌发生的重要机制。腺瘤样结肠息肉(APC)易感基因是一种抑癌基因，对于调节细胞生长和自身稳定具有重要作用，APC基因发生突变、截短失去活性是大肠肿瘤发生的早期分子事件，而且稳定存在于肿瘤发生发展的全过程，本研究探讨APC基因截短在大肠腺瘤及大肠癌的表达水平及其在大肠癌早期诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 我院病理科2012年7月至2013年8月34例大肠癌病理标本、28例大肠腺瘤标本及同期正常大肠组织标本15例。纳入标准：大肠癌、大肠腺瘤标本均是经过病理学检查确诊的；排除标准：炎症性肠病患者、家族型肠息肉病史、慢性溃疡性结肠炎病史。大肠癌组男18例、女16例，年龄55～67〔平均(53.1±13.5)〕岁；根据全国大肠癌病理研究分期(Dukes)分期，分为A期8例、B期14例、C期7例、D期5例；其中高分化腺癌9例、中分化腺癌13例、低分化腺癌12例；大肠腺瘤组男15例、女13例，年龄55～69〔平均(55.1±14.2)〕岁；其中管状腺瘤12例、绒毛腺瘤10例、混合腺瘤6例；正常组男性9例、女性6例，年龄55～70〔平均(52.5±14.7)〕岁。3组年龄、性别差异均不显著(P>0.05)。

1.2试剂与仪器 MyCycler PCR 仪(美国伯乐公司)，小型台式离心机(Sigma 1-15)，电子分析天平(Satorius)，微量加样器(Gilson)，Powerpac Universal 电泳仪(Bio-rad)，组织DNA提取试剂盒(美国Omega公司)，TNT®T7 Quick for PCR DNA(美国Omega公司)， SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒 (北京博奥森生物技术有限公司) 。

1.3实验方法 利用蛋白截短检测技术。取所有标本，根据DNA提取试剂盒说明书，提取组织DNA,并溶于无菌双蒸水，冻存于-20℃冰箱以备用；根据APC基因的第15外显子序列设计4对引物，所有上游引物5’端都连接T7启动子序列和翻译序列，由上海生工生物有限公司合成。15A正义:T7-CAAATCCTAAGAGAGAACAAC，15A反义:CACAATAAGTCTGTATTGTTTCTT。15B正义:T7-GATGATGAAAGTAAGTTTTGCAGTT，15B反义:GAGCCTCATCTGTACTTCTGC。15C正义:T7-TCACCTCATCATTACACGCCTAT，15C反义:TGAAAGTTGACTGGCGTAC。15D正义:T7-AGTGAGTCTGCCTCCAAAGGAC，15D反义:TCACAAGGTAAGACCCAGA。多聚酶链反应(PCR)扩增反应条件：预变性温度 95℃ 2 min，变性 95℃45 s，退火温度50℃，45 s，根据碱基片段长度计算延伸适当的时间，1 min 延伸1 000 bp，共35个循环，最后延伸 72℃ 5 min〔2〕。TNT 体外翻译蛋白质：所有操作严格按照TNT®T7 PCR Quick Master Mix试剂盒进行，体系：模板3 μl(PCR扩增产物)，TNT®T7 PCR Quick Master Mix 20 μl，甲硫氨酸1 mol/L 0.5 μl，H2O 1 μl，FluoroTectTMGreenLys tRNA 0.5 μl (Promega USA)。同时做阴性参照组(不加DNA模板)和正常对照组(正常组织PCR扩增产物)，将翻译的蛋白产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行结果分析。

1.4判断标准 电泳后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶由胶板取下，去除浓缩胶在ddH2O冲洗干净后，在荧光或激光激发分子成像系统下进行荧光扫描分析，并留图存档。电泳结果的判定：正常个体和无截短的突变个体为一条全长肽链，带终止突变的杂合体为两条带，带终止突变的纯活体为一条截短肽链，截短肽链比全长肽链迁移率大，如果出现截短肽链，则判定该样本存在截短型突变(+)。

1.5统计方法 采用SPSS10.0软件进行配对t和χ2检验。

2 结 果

2.1各组APC蛋白截短表达情况 正常组APC蛋白截短(+)为0%，大肠腺瘤组42.86%，大肠癌组47.06%，大肠腺瘤组和大肠癌组表达差异不显著(P>0.05)；正常组与大肠腺瘤、大肠癌组差异显著(χ2=8.917、P=0.003，χ2=10.481、P=0.001)。

2.2不同大肠瘤组织类型的APC蛋白截短表达情况 管状腺瘤组织的APC蛋白截短(+)(75.00%)显著高于绒毛腺瘤组织(20.00%)和混合腺瘤组织(16.67%)(P<0.05)；绒毛腺瘤组织和混合腺瘤组织差异不显著(P>0.05)。

3 讨 论

及时处理腺瘤对降低结直肠癌的发病率具有重要的意义，因此早期腺瘤检查是降低患者死亡率，提高生存率的关键。APC基因位于染色体5q21，含有15个外显子，编码2 843个氨基酸残基组成的蛋白质，表达于细胞核内，具有调节细胞生长和自身稳定的作用〔3〕。APC基因是家族性腺瘤样息肉易感基因，散发性结肠肿瘤中APC基因的表达也发生改变。APC基因的15外显子占其基因编码区的75%,是突变密集区〔4〕。APC基因突变导致其编码的APC蛋白结构变化，产物多为截短的多肽，截短的APC蛋白可以竞争性与野生型的APC全长蛋白结合形成二聚体，阻止野生型APC全长蛋白形成同源二聚体，使其不能正常发挥生理功能，影响细胞黏附、生长、分化、增殖、凋亡和信号传导等正常生物学特性的改变，发生细胞癌变〔5〕。

APC基因是一种抑癌基因〔6〕，在结直肠癌发生的起始阶段扮演了“看门人”的作用，功能是维持结肠上皮的完整性〔7〕。APC基因突变或者失活将导致上皮增生并发展为早期腺瘤，即APC基因突变在正常细胞至癌细胞的转变中一直存在〔8〕。蛋白截短检测技术是基于PCR、转录与翻译相结合的基础上，从蛋白质水平选择性检测终止型突变的方法，主要应用于长片段中发生截短型突变基因疾病的筛查，单次可以检测长达2～3 kb的基因片段。本研究提示APC基因突变在正常组织不存在，只有大肠内皮细胞出现瘤变时才会检测到APC基因突变，即APC基因改变在腺瘤阶段就已经发生，此后一直保存下去，它的失活是大肠肿瘤发生的早期分子生物改变，且稳定保持此状况于肿瘤发生的全过程〔9〕，通过蛋白截短技术对易感人群进行筛查，可以对于早期大肠瘤变进行诊断，有利于大肠癌及大肠瘤患者的早期治疗。而且APC蛋白截短的表达与大肠腺瘤的病理分型有关，研究结果显示APC蛋白截短在管状腺瘤表达的阳性率为75%，明显高于绒毛状腺瘤和混合腺瘤，对于临床大肠腺瘤的病理分型有一定的指导作用〔10〕。APC蛋白截短是否可以作为大肠癌早期诊断的标准，是否可以作为抗肿瘤滞留的靶点，还需要进一步研究。

4 参考文献

1代 珍,郑荣寿,邹小农,等.中国结直肠癌发病趋势分析和预测〔J〕.中华预防医学杂志,2012;46(7): 598-603.

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5张 斌,吴晓冬,杨 蕾,等.大肠侧向发育型肿瘤中APC和P53基因的检测分析〔J〕.中华消化内镜杂志,2011;28(12): 695-7.

6蔡相军,王福荣,王春喜,等.结肠癌术后早期肝转移的相关基因分析〔J〕.中国医科大学学报，2011;40(6)：549-52.

7张 曹，杨银学，杜 勇,等.大肠癌患者粪便与癌组织APC基因突变检测的一致性研究〔J〕.宁夏医科大学学报， 2014;36(4)： 364-7.

8Lapierre M,Bonnet S,Bascoul-Mollevi C,etal. RIP140 increases APC expression and controls intestinal homeostasis and tumorigenesis〔J〕.J Clin Invest,2014;124(5): 1899-913.

9Feng M,Fang X,Yang Q,etal.Association between the APC gene D1822V variant and the genetic susceptibility of colorectal cancer〔J〕.Oncol Lett,2014;8(1):139-44.

10Deming DA,Leystra AA,Nettekoven L,etal.PIK3CA and APC mutations are synergistic in the development of intestinal cancers〔J〕.Oncogene,2014;33(17): 2245-54.