中性粒细胞丝氨酸蛋白酶及其抑制剂与炎症

邓 振，何庆丰，彭礼飞，

（1.广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞 523808；2.广东医学院寄生虫学与临床寄生虫检验学教研室，广东湛江 524023）

中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（neutrophil serine proteases，NSPs）是在中性粒细胞中表达的蛋白水解酶，正常生理情况下储藏于胞质颗粒中，包括中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、组织蛋白酶 G（cathepsin G，CG）、蛋白酶 3（proteinase 3，PR3）以及中性粒细胞丝氨酸蛋白酶4（neutrophil serine proteinase 4，NSP4）。当机体发生组织损伤或病菌感染时，中性粒细胞激活并发生脱颗粒作用，NSPs被释放至细胞外，进而在机体急性感染、炎症、组织损伤或坏死、急性溶血和失血、急性中毒以及恶性肿瘤等情况时发挥着重要作用；而中性粒细胞的异常激活引起的过量NSPs也会通过水解其特异性底物而直接导致组织损伤，并参与多种器官的炎症反应［1］，可能是炎症反应中各种原因导致组织损伤的共同通路。本文就NSPs及其抑制剂对炎症反应的调控作用进行综述。

1 中性粒细胞丝氨酸蛋白酶的生物学功能

1.1 弹性蛋白酶 中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）储存于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中或表达在被细胞因子初次激活的细胞表面。其作用底物广泛，包括几乎所有的细胞外基质蛋白及多种可溶性蛋白，但最适底物为弹性蛋白。NE参与构成机体防御系统，可以协助清除异源性物质、参与调节炎症反应和促进吞噬细胞消除有害病菌，因此NE是机体受到威胁的重要保护介质，但同时过度的NE激活也会引起机体损伤和炎症反应的发生。

正常生理条件下，当机体组织受到有害物质入侵时，中性粒细胞便在局部聚集、激活并脱颗粒，释放出不超过总量2%的NE分解胞外基质，从而使得中性粒细胞顺利通过血脑屏障进入炎症部位，并通过细胞吞噬作用杀死和溶解致病微生物。但在疾病条件下，中性粒细胞的过度激活可释放出多达总量12%的NE到达细胞表面［2］，NE的过度富集不仅可以降解细胞外基质、增加组织通透性、促进中性粒细胞渗出及向炎症部位趋化集中，释放IL-8、TNF-α等炎症因子促进炎症反应，而且可以催化caspase-3诱导的细胞凋亡，进而引发机体多种炎症相关疾病［3］。

1．2 组织蛋白酶G 组织蛋白酶G（CG）存在于中性粒细胞颗粒中并从炎症部位释放，能杀死、降解病原体，重组组织，并激活促炎症细胞因子和受体；也有研究发现CG存在于一系列抗原递呈细胞的胞吞囊泡内，能参与MHCⅡ的抗原递呈过程，而且CG能通过胞吞作用进入原本不表达的细胞，扩大其发挥抗原提呈作用的细胞范围［4］。更多的研究表明，CG不仅在水解胞外基质及免疫应答中具有重要作用，而且在细胞凋亡、趋化作用和凝血过程中具有重要作用［5］。

1．3 蛋白酶3 蛋白酶3（PR3）主要储存在中性粒细胞的嗜天青颗粒和单核细胞的过氧化物酶阳性溶酶体中，受到炎症刺激时可以在细胞表面表达。虽然PR3与NE都属于NSPs，序列相近性和亚基相似度较高，但它们却有不同的生物学功能。PR3的细胞内特异性亚基使其可以参与细胞增殖和凋亡的调控，而它作为膜表面蛋白又与急性炎症反应密切相关，同时还是抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）的主要靶抗原之一，在许多自身免疫性疾病的临床检测中具有重要意义［6］。

1．4 中性粒细胞丝氨酸蛋白酶4 NSP4是继NE、CG及PR3之后在中性粒细胞中发现的第4种丝氨酸蛋白酶，它是于2012年由Perera等［7］发现并命名的。NSP4存在于中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒中并在激活状态下释放，分子质量较低，在脊椎动物中高度保守，结构上与NE和PR3相似性高达39%［7］；但由于NSP4含量很少，约为CG含量的5%，所以其研究一直以来都被忽略了，相关报道也极为少见。有研究发现，NSP4敲除的小鼠在无病原菌生存条件下未表现出任何异常，故其主要在病原微生物入侵过程中起到一定的防御作用［8］。

2 中性粒细胞丝氨酸蛋白酶调控炎症反应

中性粒细胞的免疫位点被激活后，大量NSPs被释放到细胞外环境中，一部分释放出的蛋白酶结合在质膜外表面上并保持着一种激活状态，所以可溶性NSPs和膜结合NSPs都可以发挥蛋白水解活性，调控多种趋化因子、细胞因子、生长因子和细胞表面受体的活性。同时，分泌出的蛋白酶还可以激活淋巴细胞和粘附分子，进一步调控免疫应答和炎症反应。

由于一直以来研究较多的NSPs主要为NE、CG和PR3，而NSP4是最近才发现的，相关研究极少，故此处总结了这3种最主要的NSPs与炎症反应的研究情况。

2.1 弹性蛋白酶 弹性蛋白酶与多种气道疾病密切相关，并调节促炎症因子的释放，参与炎症反应。支气管扩张是一种慢性肺部炎症疾病，与病原菌感染、免疫缺陷和自身免疫系统紊乱有关。Chalmers等［9］的研究发现支气管扩张炎症与中性粒细胞密切相关，中性粒细胞可在多种促炎因子作用下迁移到气道部位抵抗病原菌侵害和炎症反应，然而NE可以通过剪切吞噬细胞受体和激活的补体而抑制中性粒细胞的作用进而导致炎症发生。慢性阻塞性肺疾病是被世界卫生组织认定为引起疾病死亡的第四大因素，Lucas等［10］的研究表明，NE是在慢性阻塞性肺疾病炎症反应过程中作用最为重要的一种丝氨酸蛋白酶，30多年以前就是慢性阻塞性肺疾病的治疗靶点，蛋白酶－抗蛋白酶的平衡失调可导致胞外NE激增，寻求有效的低分子量NE抑制剂具有重要的研究意义。慢性阻塞性肺疾病的急性恶化中，NE释放量增多是一个极为明显的变化，Hoenderdos等［11］的研究中发现包括NE在内的NSP是慢性阻塞性肺疾病组织损伤的关键调控因素，与炎症反应密切相关。有研究表明NE可以通过上调核转录因子-κB（NF-κB）和激活因子蛋白-1（activator protein 1，AP-1），促进IL-8的合成和释放，促进炎症反应的发生和发展［12］。

2．2 组织蛋白酶G 组织蛋白酶G与溃疡性疾病、急性炎症反应密切相关，甚至参与了恶性肿瘤如肺癌的发病过程。在中性粒细胞黏合到免疫复合物上的过程中，CG与细胞表面整联蛋白相互作用，促进整联蛋白聚合、细胞支架重排和随后的中性粒细胞趋化因子的释放，进而促进炎症反应过程的发生［5］。Dabek等［13］的研究发现CG与溃疡性结肠病有关。CG存在于溃疡性结肠病人的结肠腔中，可以通过激活位于肠上皮细胞顶侧的蛋白酶激活受体-4（PAR-4）而导致上皮屏障破坏，促进炎症反应。

2．3 蛋白酶3 蛋白酶3作为抗中性粒细胞胞质抗体的主要靶抗原，参与了许多自身免疫性疾病和炎症反应的调控。细胞外的PR3通过N-末端剪接使中性粒细胞和内皮细胞释放IL-8并产生趋化因子，促使中性粒细胞被招募到炎症部位；同时PR3作为促TNF-α因子的转化酶，可以促进膜结合的潜在促炎症因子TNF-α的转化，促进炎症反应［14］。中性粒细胞表面的膜结合PR3是韦氏肉芽肿病的抗中性粒细胞胞质抗体的首要抗原靶标。Arias-Loste等［15］发现PR3也参与了炎性肠病的发生发展过程，他们的研究通过检测142个血清标本发现抗PR3-抗中性粒细胞胞质抗体可以作为炎性肠病的血清学标记。Kwon等［16］于2013年的研究发现PR3也参与了过量中性粒细胞进入脑部引起的神经炎症的发病过程，蛋白酶处理原代培养的大脑皮层神经元可以明显诱导活性氧分子的产生、降低总谷胱甘肽含量、阻断线粒体膜电位、促进细胞凋亡以及诱导神经元死亡，这说明PR3在神经炎症的发病及调控过程中具有重要作用。

3 中性粒细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂对炎症反应的防治作用

3.1 内源性中性粒细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂 中性粒细胞胞质中含量很高的SerpinB1可以有效地抑制NSPs的活性，参与炎症反应的调节；人体肝脏也可以产生内源性的NSP抑制剂，如 α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，α1-PI）及 α-巨球蛋白（α-macroglobulins），它们随血液和细胞间液在机体中循环游走，以有效中和机体释放出的过量NSPs的作用；另外，还有一些组织特异性的NSPs抑制剂，如（secretory leukocyte protease inhibitor，SLPI）和 elafin，这两者可以有效调节细胞间液蛋白酶的活性。这些内源性抑制剂通常是对几种NSP或其他蛋白酶同时具有抑制作用。

SerpinB1在所有的骨髓白细胞中表达，甚至包括干细胞和祖细胞。它可以有效地抑制NSPs的NE、CG和PR3的活性。Gong等［17］的研究表明SerpinB1可以通过抑制NSPs的活性以及减少促炎症因子 TNF-α、IL-6、KC／CXCL1、G-CSF、IL-17A及MCP-1／CCL2的产生，调控流行性感冒中的肺部炎症反应。α1-抗胰蛋白酶是机体重要的内源性NSPs抑制剂，可以以自杀性底物抑制的方式有效抑制NE及CG的活性。α1-抗胰蛋白酶是机体先天免疫反应中的抗炎蛋白，其缺失与肺气肿及肝疾病密切相关。Ekeowa等［18］的研究发现α1-抗胰蛋白酶与慢性阻塞性肺病有关。SLPI的β发夹结构的N端可与胰蛋白酶结合，而C端可与中性粒细胞弹性蛋白酶结合，可自由穿过中性粒细胞与基质间的空隙而在较大范围内调控蛋白酶的活性。除主要抑制NE和胰蛋白酶的活性以外，SLPI还可以作用于CG，并作为一种多效应蛋白参与先天免疫、抗炎反应和病原体感染等过程。Guerrieri等［19］研究了SLPI对淋巴细胞增殖和细胞因子产生的影响，他们发现SLPI处理的单核细胞条件培养基，可以抑制CD4＋淋巴细胞的增殖和I型助T细胞因子的分泌，并影响包括γ干扰素、IL-4、IL-6及IL-10在内的其它细胞因子的分泌，这提示SLPI可能也参与了后天免疫过程。elafin与SLPI具有40%的同源性，是NE、PR3以及胰腺弹性蛋白酶的特异性抑制剂，但对CG没有明显的抑制作用。Motta等［20］研究表明elafin可以通过调控一系列炎症介质和增强肠壁屏障作用抑制大肠炎老鼠模型中的大肠发炎，可能成为肠炎疾病的一个治疗靶点。Wang等［21］研究也表明血浆NE和elafin的平衡失调与急性呼吸窘迫综合征的发生发展密切相关，在急性呼吸窘迫综合征的早期elafin急速降低。

人内源性NSPs抑制剂不仅可以抑制机体自身丝氨酸蛋白酶的活性，而且可以调节细胞因子和趋化因子的释放，调节机体的先天免疫功能以及发挥多层次的抗炎作用。但是被激活的中性粒细胞可以通过以下途径阻止内源性蛋白酶抑制剂对NSPs的抑制。首先，中性粒细胞可产生大量自由基致使氧敏感的内源性NSPs抑制剂失活；其次，NSPs可与弹性蛋白结合到一起抵制内源性蛋白酶抑制剂的抑制作用。最后，NE和细胞溶酶体中其他蛋白酶能结合于阴离子表面可得到保护而不被破坏。另外也有研究表明，激活的中性粒细胞释放的其他蛋白酶如MMP-9也可以降解NSP抑制剂如丝氨酸蛋白酶抑制剂α1-抗蛋白酶，从而延长NE蛋白裂解时间、增强蛋白裂解［22］。

3.2 外源性中性粒细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂 由于内源性抑制剂抑制作用的局限性以及机体自身调节功能的有限性，开发外源性NSPs抑制剂以应用于临床治疗具有迫切的市场需求和重要的医学研究价值。目前主要对NE抑制剂有较多研究［23］，对CG抑制剂近年也有少量研究［24］，而对PR3及NSP4的抑制剂研究极少。目前外源性NSPs抑制剂主要有化学合成抑制剂、天然性抑制剂以及一些其他天然模拟肽和非肽化合物。

3.2.1 化学合成抑制剂 化学合成类NSPs抑制剂根据化学结构可以分为多肽类和非多肽类结构。目前对NE抑制剂关注较多，大多数化学合成NE抑制剂存在毒性较大、化学稳定性较低、体内有效活性低和药效延续性差等问题，因此直至目前只有ONO-5046（sivelestat sodium，西维来司钠）是唯一成功进入临床的化学合成中性粒细胞弹性蛋白酶特异性抑制剂［25］。正在进行临床研究的NE抑制剂AZD9668亦表现出较好的结果［26］。目前发现的CG抑制主要为β-ketophosphonic acids、氨基膦酸酯、乳香脂酸（boswellic acids）等的衍生物及基于α1-PI、BPTI设计的模拟肽等［24］，但还没有CG抑制剂进入临床研究。

3.2.2 天然性抑制剂 天然性NSPs抑制剂主要是指一些中药提取类物质，根据其化学结构不同可分为酚类化合物（如EGCG可以以非竞争性抑制方式明显抑制NE的作用，且活性高出内源性抑制剂α1-抗胰蛋白酶30倍之多［27］）、萜类化合物（如PL3S能够通过作用钙离子、AKT和p38信号通路抑制中性粒细胞的脱颗粒，进而抑制超氧自由基的产生和 NE的释放［28］）以及吲哚类生物碱［如 4-（4，6-dihydroxy-3-methoxy-3H-isoindol-1-yl）-benzoic acid在体外实验中可以明显抑制 NE的活性［29］］等。

3.2.3 重组多肽抑制剂 目前对NE的多肽特异抑制剂地来司他（depelestat）-一种由58个氨基酸残基组成的重组多肽，已完成治疗ARDS的临床Ⅱ期研究。我们最近也分离到一种特异性好、活性强的NE多肽抑制剂-AduTIL1［30］，在后续的急性肺损伤及棉球肉芽肿动物实验中表现出较好的抗炎作用效果。

4 结语与展望

NSPs与炎症反应密切相关。炎症反应时，激活的中性粒细胞可释放出过量的NSPs，上调细胞黏附分子，促进中性粒细胞与内皮细胞黏附及组织浸润、释放促炎症分子、激活补体以及诱导细胞因子表达，而这些物质又能吸引和激活中性粒细胞释放更多的NSPs，这些多重效应构成了一个NSPs释放的级联放大反应而形成恶性循环，使炎症反应明显放大。因此，针对NSPs靶点的抑制剂可能用于防治炎症性反应疾病，而寻求高效、可靠的NSPs抑制剂，有望开发出高效的炎症性疾病防治新药。然而，虽然目前有关NE抑制剂的研究得到较大关注，但对CG、PR3及NSP4抑制剂的研究重视程度尚远远不够。此外，由于几种NSP具有相似结构，如何筛选和设计对各NSP具有抑制特异性的抑制剂也是需要面对的重要问题。

参考文献：

［1］Heutinck K M，ten Berge I J，Hack C E，et al.Serine proteases of the human immune system in health and disease［J］.Mol Immunol，2010，47（11－12）：1943－55.

［2］Steven SD.Neutrophil elastase：path clearer，pathogen killer，or just pathologic［J］？.Am J Respir Cell Mol Biol，2002，26（3）：266－8.

［3］Jochum M，Gippner-Steppert C，Machledit W，et al.The role of phagocyte proteinases and proteinase inhibitors in multiple organ failure［J］.Am J Respir Crit Care Med，1994，150（6 Pt 2）：S123－30.

［4］Burster T，Macmillan H，Hou T，et al.Cathepsin G：roles in antigen presentation and beyond［J］.Mol Immunol，2010，47：658－65.

［5］Gregory A D，Houghton A M.Tumor-associated neutrophils：new targets for cancer therapy［J］.Cancer Res，2011，71（7）：2411－6.

［6］Hajjar E，Broemstrup T，Kantari C，et al.Structures of human proteinase 3 and neutrophil elastase-so similar yet so different［J］.FEBSJ，2010，277（10）：2238－54.

［7］Perera N C，Schilling O，Kittel H，et al.NSP4，an elastase-related protease in human neutrophils with arginine specificity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2012，109（16）：6229－34.

［8］Perera N C，Jenne D E.Perspectives and potential roles for the newly discovered NSP4 in the immune system［J］.Expert Rev Clin Immunol，2012，8（6）：501－3.

［9］Chalmers J D，Hill A T.Mechanisms of immune dysfunction and bacterial persistence in non-cystic fibrosis bronchiectasis［J］.Mol Immunol，2013，55（1）：27－34.

［10］Lucas SD，Costa E，Guedes R C，et al.Targeting COPD：advances on low-molecular-weight inhibitors of human neutrophil elastase［J］.Med Res Rev，2013，33（Suppl 1）：E73－101.

［11］Hoenderdos K，Condliffe A.The neutrophil in chronic obstructive pulmonary disease［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2013，48（5）：531－9.

［12］Chen H C，Lin H C，Liu C Y，et al.Neutrophil elastase induces IL-8 synthesis by lung epithelial cells via the mitogen-activated protein kinase pathway［J］.J Biomed Sci，2004，11（1）：49－58.

［13］Dabek M，Ferrier L，Annahazi A，et al.Intracolonic infusion of fecal supernatants from ulcerative colitis patients triggers altered permeability and inflammation in mice：role of cathepsin G and protease-activated receptor-4［J］．Inflamm Bowel Dis，2011，17（6）：1409－14.

［14］ Bank U，Ansorge S.More than destructive：neutrophil-derived serine proteases in cytokine bioactivity control［J］.J Leukoc Biol，2001，69（2）：197－206.

［15］Arias-Loste M T，Bonilla G，Moraleja I，et al.Presence of antiproteinase 3 antineutrophil cytoplasmic antibodies（anti-PR3 ANCA）as serologic markers in inflammatory bowel disease［J］.Clin Rev Allergy Immunol，2013，45（1）：109－16.

［16］Kwon K J，Cho K S，Kim JN，et al.Proteinase3 induces oxidative stress-mediated neuronal death in rat primary cortical neuron［J］.Neurosci Lett，2013，548：67－72.

［17］Gong D，Farley K，White M，et al.Critical role of serpin B1 in regulating inflammatory responses in pulmonary influenza infection［J］.J Infect Dis，2011，204（4）：592－600.

［18］Ekeowa U I，Gooptu B，Belorgey D，et al.alpha1-antitrypsin deficiency，chronic obstructive pulmonary disease and the serpinopathies［J］.Clin Sci（Lond），2009，116（12）：837－50.

［19］Guerrieri D，Tateosian N L，Maffía P C，et al.Serine leucocyte proteinase inhibitor-treated monocyte inhibits human CD4（＋）lymphocyte proliferation［J］.Immunology，2011，133（4）：434－41.

［20］Motta JP，Magne L，Descamps D，et al.Modifying the protease，antiprotease pattern by elafin overexpression protects mice from colitis［J］.Gastroenterology，2011，140（4）：1272－82.

［21］Wang Z，Chen F，Zhai R，et al.Plasma neutrophil elastase and elafin imbalance is associated with acute respiratory distress syndrome（ARDS）development［J］.PLoS One，2009，4（2）：e4380.

［22］Liu Z，Zhou X，Shapiro SD，et al.The serpin alpha1-proteinase inhibitor is a critical substrate for gelatinase B／MMP-9 in vivo［J］.Cell，2000，102：647－55.

［23］SjöP.Neutrophil elastase inhibitors：recent advances in the development of mechanism-based and nonelectrophilic inhibitors［J］.Future Med Chem，2012，4（5）：651－60.

［24］Kosikowska P，Lesner A.Inhibitors of cathepsin G：a patent review（2005 to present）［J］.Expert Opin Ther Pat，2013，23（12）：1－14.

［25］Feng L，Zhu W，Huang C，et al.Direct interaction of ONO-5046 with human neutrophil elastase through H NMR and molecular docking［J］.Int J Biol Macromol，2012，51（3）：196－200.

［26］Stockley R，De Soyza A，Gunawardena K，et al.PhaseⅡ study of a neutrophil elastase inhibitor（AZD9668）in patients with bronchiectasis［J］.Respir Med，2013，107（4）：524－33.

［27］Sartor L，Pezzato E，Garbisa S.（－）Epigallocatechin-3-gallate inhibits leukocyte elastase：potential of the phyto-factor in hindering inflammation，emphysema，and invasion［J］.J Leukoc Biol，2002，71（1）：73－9.

［28］Chang H L，Chang F R，Chen JS，et al.Inhibitory effects of 16-hydroxycleroda-3，13（14）E-dien-15-oic acid on superoxide anion and elastase release in human neutrophils through multiple mechanisms［J］.Eur J Pharmacol，2008，586（1－3）：332－9.

［29］Kim Y H，Ryoo IJ，Choo SJ，et al.Clitocybin D，a novel human neutrophil elastase inhibitor from the culture broth of Clitocybe aurantiaca［J］.J Microbiol Biotechnol，2009，19（10）：1139－41.

［30］Jin X，Deng L，Li H，et al.Identification and characterization of a serine protease inhibitor with two trypsin inhibitor-like domains from the human hookworm Ancylostoma duodenale［J］.Parasitol Res，2011，108（2）：287－95.