氯胺酮、咪达唑仑复合麻醉对大鼠认知功能的影响

赵艳梅 杨丽梅 李 倩 陈 宁

(武警后勤学院防护医学教研室，天津 300309)

全身麻醉后大脑发生基因表达〔1〕、β淀粉样沉积〔2〕、神经元凋亡〔3，4〕等广泛而持久的变化，单纯的短时间麻醉即可造成实验动物长时间的认知功能障碍〔5～7〕，临床上称为术后认知功能障碍(POCD)，表现为认知能力异常、记忆受损、焦虑、人格改变、精神错乱等，严重者可出现痴呆，其确切机制不明。本文探讨氯胺酮、咪达唑仑复合麻醉后对大鼠认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 雄性Wistar大鼠16只，SPF级，体重180～220 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK-(军)2007-004。氯胺酮(连云港恒瑞制药公司，批号KH050201)、咪达唑仑(江苏恩华药业集团有限公司，批号20090211)；Y迷宫(张家港市生物医学仪器厂)；DY-89 Ⅱ型电动玻璃匀浆器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；RNA提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；TaKaRa RNA PCR Kit AMV3.0(大连宝生物工程有限公司)；100 bp DNA MarkerⅠ、GoldView核酸染料(北京博迈德科技发展有限公司)；琼脂糖(Sigma)，引物合成由北京奥科生物技术有限公司完成。

1.2大鼠模型制备及分组 雄性Wistar大鼠随机分为两组，对照组和麻醉组，每组8只，麻醉组参照文献〔8〕给予腹腔注射氯胺酮75 mg/kg、咪达唑仑5 mg/kg进行麻醉诱导。麻醉起效时间以翻正反射消失为标准。以大鼠前爪不能自行翻转为俯卧位，且维持时间≥10 s作为大鼠前爪翻正反射消失的标准。对照组腹腔注射等体积的生理盐水。

1.3麻醉诱导对大鼠认知功能的影响(Y迷宫实验) 动物适应环境3 d后在安静的暗室内用Y迷宫测定。Y迷宫箱底为铜栅间隔，每臂末端有信号灯，灯亮时箱底的铜栅无电流，提示为安全区。每次测试均在同一时间段进行，测试时调节刺激电压以保证大鼠在10 s内逃避跑动，大鼠受电击后直接跑到安全区为正确反应，否则为错误反应。每次大鼠跑至安全区后持续光亮30 s，继而转换灯光进行下一次测试，灯光出现的方位按照随机次序变换，直至连续10次中有9次正确反应即为达到学会标准。两组动物麻醉后继续饲养7 d，每日继续进行Y迷宫实验，于第7天迷宫实验结束后处死动物，观察麻醉诱导对大鼠认知功能的影响。

1.4麻醉诱导对大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体(NR)1、NR2B基因表达的影响 Y迷宫实验结束后立即断头处死大鼠，于冰台上分离双侧海马，立即装入EP管中置于液氮保存备用。根据NR1(GenBank NM_017010.1)、NR2B(GenBank M91562.1)和β-actin (GenBank NM_031144)cDNA序列，采用Primer Premier 5.0软件自行设计引物，序列如下：正义链：Sense：5′-TCGGTATCAGGAATGCG-3′，反义链：5′-GGTGCTCGTGTCTTTGG-3′；NR2B：正义链：5′-GCTCAGCGACCTGTATGG-3′，反义链：5′-TCGTCACTGCGTTCTTTGT-3′；β-actin：正义链：5′-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3′，反义链：5′-TGGAAGGTGGACAGTGAGGC-3′。PCR反应条件如下：循环条件：94℃ 45 s，54℃ 45 s，72℃ 45 s；34(β-actin为30)个周期，产物长度：NR1 328 bp，NR2B 381 bp，β-actin 448 bp。RNA提取方法按照试剂盒说明书进行。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪下观察结果，图像采用Image J分析软件进行处理。以目的基因条带的综合光密度与β-actin基因条带综合光密度的比值作为目的基因的相对含量。

1.5统计学方法 采用SPSS10.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1大鼠麻醉诱导一般状况观察 大鼠在整个麻醉诱导实验中，状态平稳，无竖毛、易激惹、流涎、呼吸急促等现象，实验动物均无死亡现象发生。麻醉起效时间(翻正反射消失时间)为(2.08±0.32) min，<5 min，自然复苏时间为(65.12±9.25) min，说明腹腔注射氯胺酮75 mg/kg和咪达唑仑5 mg/kg可诱导产生可靠的麻醉复苏动物模型。

2.2麻醉诱导对大鼠认知功能的影响 麻醉组与正常对照组相比，正确反应次数显著下降(7.88±1.25 vs 9.63±0.52，t=3.787，P=0.002)。提示氯胺酮、咪达唑仑复合麻醉对大鼠短期(1 w)学习记忆能力有一定损害作用。

2.3麻醉诱导对 NR1、NR2B基因表达的影响 麻醉组与正常对照组相比，大鼠海马组织内NR2B mRNA表达量显著降低(66.36±12.33 vs 100±0,t=4.14，P=0.001)，NR1 mRNA表达量无明显变化(97.61±9.05 vs 100±0,t=0.89，P=0.67)。说明氯胺酮、咪达唑仑复合麻醉可降低海马部位的NR2B的mRNA表达，对海马内NR1的表达无明显影响。

3 讨 论

NR是海马参与学习记忆功能的一个重要受体。氯胺酮是一种NR的非竞争性拮抗剂，它主要通过作用于NR门控的离子通道中PCP 位点，减少NR通道开放时间和频率，从而阻断各种刺激后产生的长时程增强效应(LTP)效应，干扰学习记忆过程〔9〕。王丹等〔10〕给小鼠注射较大剂量的氯胺酮(10～20 mg/kg)后发现小鼠记忆功能受到损害，并且这种损害作用似呈剂量依赖关系。刘毓和等〔11〕的研究表明，氯胺酮对老年大鼠认知功能有短暂的抑制作用。研究发现，反复注射麻醉剂量的氯胺酮〔12〕或小剂量氯胺酮〔13〕可对大鼠认知功能产生损害，新生1周龄大鼠腹腔注射一次氯胺酮即可出现空间辨别学习记忆能力下降，其机制可能与NMDA2受体和谷氨酸转运体蛋白I 的改变有关〔14〕。多项临床研究也发现，氯胺酮依赖患者存在明显的认知功能损害〔15，16〕。由此可见，应用氯胺酮可能引起大脑学习记忆功能的变化，从而导致术后认知功能障碍的发生。

研究发现，镇静剂量的咪达唑仑可以抑制大鼠的记忆获得和巩固并维持较长一段时间〔17〕，大鼠腹腔注射咪达唑仑可出现东莨菪碱所致的认知功能障碍加重的现象〔18〕，因此认为咪达唑仑可能也是导致术后认知功能障碍的一个重要因素。

海马是NR的富含区域，NR 的这几种亚型在海马都有表达，但以NR1、NR2A及NR2B为主。NR与学习记忆密切相关，其中NR2B与之最为密切〔19〕。本研究说明氯胺酮、咪达唑仑复合麻醉可降低海马部位的NR2B的mRNA表达，提示海马组织内NR2B表达下降可能与认知障碍的产生关系密切，该结果与以往研究相一致〔20，21〕。

由于学习记忆是一个十分复杂的神经活动过程，涉及多个脑区、多种神经递质、细胞内信号分子和基因表达等因素，除了谷氨酸递质系统外，还涉及胆碱能系统和其他递质系统，存在多个受体及蛋白分子之间的相互作用，具体氯胺酮和咪达唑仑如何影响认知过程，通过哪些信号分子起作用，尚有待于进一步深入研究。

4 参考文献

1Mawhinney LJ，de Rivero Vaccari JP，Alonso OF,etal.Isoflurane/nitrous oxide anesthesia induces increases in NMDA receptor subunit NR2B protein expression in the aged rat brain〔J〕.Brain Res,2012；1431(11):23-34.

2Xie Z,Dong Y,Maeda U,etal.The common inhalation anesthetic isoflurane induces apoptosis and increases amyloid beta protein levels〔J〕. Anesthesiology，2006；104(5):988-94.

3Jevtovic-Todorovic V,Hartman RE,Izumi Y,etal.Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits〔J〕.J Neurosci,2003；23(3):876-82.

4Wise-Faberowski L,Zhang H,Ing R,etal.Isoflurane-induced neuronal degeneration：an evaluation in organotypic hippocampal slice cultures〔J〕. Anesth Analg,2005；101(3):651-7.

5Culley DJ,Baxter MG,Yukhananov R,etal.Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats〔J〕.Anesthesiology,2004；100(2):309-14.

6Culley DJ,Baxter M,Yukhananov R,etal.The memory effects of general anesthesia persist for weeks in young and aged rats〔J〕.Anesth Analg,2003；96(4):1004-9.

7Culley DJ,Baxter MG,Crosby CA,etal.Impaired acquisition of spatial memory 2 weeks after isoflurane and isoflurane-nitrous oxide anesthesia in aged rats〔J〕.Anesth Analg,2004；99(5):1393-7.

8Hawk TE，Leary SL. Formulary for laboratory animals〔M〕.Iowa：Iowa State University Press,1999：54.

9Orser BA，Pennefather PS，MacDonald JF.Multiple mechanisms of ketamine blockade of N-methyl-D-aspartate receptors〔J〕.Anesthesiology,1997；86(4)：903-17.

10王 丹，戴体俊.氯胺酮对小鼠避暗潜伏期及错误次数的影响及其机制〔J〕.徐州医学院学报，2006；26(3)：189-91.

11刘毓和，吴新民，杜敏逸.咪唑安定、异丙酚和氯胺酮对老年大鼠认知功能的影响〔J〕.中华麻醉学杂志，2006；26(4)：315-7.

12王志萍，武云飞，江 山，等.多次氯胺酮给药对大鼠海马CA1区突触长时程增强的影响〔J〕.中华麻醉学杂志，2006；26(4)：309-11.

13王裕贤，田玉科，杨 辉，等.腹腔重复注射小剂量氯胺酮术后镇痛对趾部切口术大鼠认知功能的影响〔J〕.中华麻醉学杂志，2005；25(3)：205-7.

14蒯建科，姚立农，于代华，等.氯胺酮对新生大鼠神经功能和海马谷氨酸受体及转运体表达的影响〔J〕.临床麻醉学杂志，2007；23(3)：218-20.

15韩洪瀛，廖艳辉，唐劲松，等.氯胺酮依赖者(吸食“K”粉者)的认知功能损害〔J〕.中国临床心理学杂志，2011；19(3)：388-9.

16尤 杰，张 焰，张邓新，等.氯胺酮全麻对患儿术后早期认知功能的影响〔J〕.临床麻醉学杂志，2008；24(11)：947-8.

17Savic MM,Obradovic DI,Ugresic ND,etal.Bidirectional effects of benzodiazepine binding site ligands on passive avoidance acquisition and retention:differential antagonism by flumazenil and beta-CCt〔J〕. Psychopharmacology(Berl),2005；180(3):455-65.

18张 捷，吴新民.咪达唑仑对东蓑若碱致大鼠认知功能障碍的影响〔J〕.中华麻醉学杂志，2007；27(2)：160-3.

19Clayton DA，Mesches MH，Alvarez E,etal.A hippocampal NR2B deficit can mimic age-related changes in long-term potentiation and spatial learning in the Fischer 344 rat〔J〕.J Neurosci,2002；22(9):3628-37.

20孙钦建，刘学武，王爱华.颞叶癫痫大鼠认知功能与海马区NR2B 表达的关系〔J〕.山东大学学报(医学版)，2008；46(7)：676-80.

21陈 谊，蔡文玮，盛 净.糖尿病模型大鼠认知功能障碍及海马N-甲基-D-天冬氨酸受体表达变化〔J〕.实用医学杂志，2010；26(17)：3098-101.