柞蚕微粒子病镜检方法介绍

2014-01-23杨旭

中国蚕业 2014年3期

杨旭

(丹东市农业技术推广中心，辽宁丹东 118000)

辽宁省丹东市是全国主要柞蚕生产基地，全市有柞蚕制种单位40 余家，年生产柞蚕种茧1 500 万粒，种卵销往辽宁省及省外柞蚕区，成为柞蚕种的生产集散地。近几年，由于部分柞蚕制种单位只注重制种中选择雌蛾，忽视或不采用显微镜对雌蛾进行微粒子病的检查，导致带有柞蚕微粒子病的种卵投入到春、秋柞蚕生产中。2013年丹东市部分放养秋柞蚕的蚕农因柞蚕微粒子病大发生，导致减产或绝收，造成严重的经济损失。2014年从全市蚕种复验情况看，个别蚕种单位购进的柞蚕母种微粒子病毒率高达2%，已严重影响到蚕种质量。因此，切实严把柞蚕种镜检关，消灭柞蚕微粒子病毒，对提高柞蚕种质量，确保蚕农用上优良、放心的柞蚕种，实现蚕业增收、蚕农增效都具有重要意义。为此，介绍了显微镜使用方法及柞蚕微粒子病镜检技术，供柞蚕种制种单位的镜检人员参考。

1 显微镜的使用方法

1.1 显微镜的安装

显微镜属光学仪器，安装时要轻拿轻放各种器件。以双筒电光源显微镜为例，按照操作步骤，拿出显微镜的镜座摆放稳定后，先安装镜筒，然后再安装目镜和物镜，物镜镜头对准载物台中央的通光孔，先逆时针方向旋转，待凸凹双方吻合时，再顺时针方向旋转，不要拧得过紧。插好电源，打开电源开关，先采用低倍物镜从目镜中观察，调节聚光器光圈(或反光镜)，至视野合适为止。双筒显微镜要调节2个目镜之间的宽度(两眼瞳孔间的距离)。

例(6)：I shall simply, for the present, talk little and eschew fire-proof gloves, lest I fall into certain dreadful habits irrevocably.

1.2 显微镜的目镜和物镜倍数

检测柞蚕微孢子虫孢子目镜的倍数采用15 倍或12.5 倍或16 倍，物镜的倍数采用40 倍。

1.3 标本样片的显微镜观察

将标本样片放置在载物台上，片样对准通光孔正中，先用粗准焦螺旋调整载物台升降，物镜下端不接触盖玻片，然后再用细准焦螺旋微调成像。

1.4 显微镜镜头的清理方法

2.2.4 镜检员须持有柞蚕种质量镜检资格证并具有熟练操作显微镜检测微孢子虫的技术人员担任。镜检员负责本镜检小组的管理工作，指导其他人员按规定程序进行操作，对制成的合格样片，利用显微镜进行柞蚕微孢子检验，负责回收检出有柞蚕微粒子孢子的样片及卵袋，做到统一管理、统一处理，并通知撕蛾人将合格卵袋放入垫有塑料纱的筐中待剥。对不同品种的母蛾镜检时，应分清批次，以防品种混杂。

1.5 显微镜的保管方法

镜检工作结束后，要将显微镜擦干净再装箱放置于干燥处进行妥善保管。

2 显微镜检查人员的组成及分工职责

2.1 镜检人员组成

柞蚕微粒子孢子常见为长椭圆形，折光性强，呈淡绿色，边缘整齐，类似“大米粒”状。

2.2 镜检室人员分工职责

2.2.1 拆袋人负责取蛾卵袋编号。按序号将要镜检的蛾卵袋口打开，按照先后顺序将蛾卵袋排好，严禁母蛾爬出蛾卵袋口，发生蛾卵袋混淆。有条件的单位，可以采用木盒竖放蛾卵袋，1个木盒可放10个蛾卵袋或自定数量，但一定要与点样片数量相符。

“侵权责任”的笼统称谓在很大程度上掩盖了各种责任形态和制度之间的实质差异。在两大法系中，所谓的“侵权责任”都不过是各种基于相异理念的责任形态的混合物，极像一幅“马赛克拼图”。这幅拼图远看是一个整体，但走近观之，却是由形色各异的板块拼凑而成。

基于LDC1000的智能循迹小车的设计与实现………………………………关志艳，张振宇，何茂荣，等(31)

2.2.2 撕蛾人负责撕蛾。用双手将蛾腹部背面第2～3 环节处撕开，配合点片人做样片。注意撕蛾位置要准确无误，严防母蛾与蛾卵袋不一致、位置颠倒。同时将镜检过的无病毒的卵袋放入铺有塑料纱的蚕筐中，将镜检中有病毒的卵袋送交镜检员等。

2.2.3 点片人负责点制样片。点片人按照标本制作要求制作样本，盖上盖玻片并用手轻轻压实后交给镜检员。点片人在制作样片时应注意不要挑到蛾的粘液腺、嗉囊部位，脂肪体太多或过少制成的样片都是不合格的样片。

显微镜镜头上如有脏物影响视野观察时，最好用擦镜纸横擦，避免划圆圈擦，有利于保护显微镜镜头。

为确保镜检质量，制种单位要安排镜检员进行初检和复检，即初检员对检镜样本怀疑时，可以由点片人员重新制片让复检员进行复检。复检有微粒子孢子的，退回初检员重检［1］。一批母蛾镜检结束后，按照NY/T 1625 －2008《柞蚕种质量》中对各级蚕种的微粒子病率的标准［2］，判定该批柞蚕种是否合格。

3 镜检样本的制作

3.1 载玻片的标准

柞蚕微粒子孢子的检查效果与样本的制作是否合格有很大的关系。显微镜是光学仪器，要求精度高，载玻片最好采用长7.5 cm、宽2.5 cm、厚1.5 mm的标准载玻片和20 mm ×20 mm 的盖玻片制成样片。为了节约成本，提高工作效率，柞蚕制种中常采用长20～25 cm、宽2.5～3.0 cm、厚2～3 mm的玻璃条代替载玻片，玻璃条最好采用同一批次的玻璃切割而成，使玻璃条的厚度一致以便于镜检。

3.2 标本片的制作

点片人用细木棍在雌蛾腹部背面第2～3 环节的节间膜处挑取少量蛾的脂肪体和体液，点在点有1%氢氧化钠的载玻片上，如是7.5 cm 长的载玻片点3个样本，如是20～25 cm 长的载玻片点10个样本，再用细木棍在载玻片上轻轻研磨，使所点片样本充分均匀，然后盖上盖玻片用手指压实，防止盖玻片与载玻片间有气泡产生。标准样本中应能观察到脂肪球、血淋巴等。

4 柞蚕微粒子孢子的镜检认定

4.1 柞蚕微粒子孢子的形状

柞蚕母蛾镜检组分为拆袋(也称打袋)、撕蛾、点片、镜检和洗片。镜检人员的增减应与制种数量和显微镜台数的多少相配合，制种数量大，镜检人员可相应增加，以加快镜检速度，一般繁制10 万粒种茧要配备1个镜检组，即镜检、拆袋、撕蛾、点片和洗片各配备1 人，超过10 万粒种茧可以增加镜检组数量。当日需检验的雌蛾，当天必须要检查完，并将合格的卵袋剥完，于傍晚进入保种室保护。倒出卵的塑料纱袋或尼龙纱袋第2 天继续装蛾产卵，确保生产正常循环。

4.2 微粒子孢子的镜检

在600～640 倍的显微镜下，观察视野中样品的流动相中含有的体液、圆形脂肪球、其它晶体等，柞蚕微粒子孢子比重大，常在流动相的下面，或沉在脂肪球的下面。柞蚕微粒子病重的雌蛾，微粒子孢子充满整个视野;柞蚕微粒子病轻的雌蛾，则有少量微粒子孢子在体液中游动，也有个例就是微粒子孢子特别少，在1个视野中只能观察到1～2个微粒子孢子，而其它视野中没有微粒子孢子，但只要发现柞蚕微粒子孢子，就要坚决淘汰“带毒”雌蛾的蚕种，一般镜检时要多观察3～4个视野，以利于柞蚕微粒子孢子的排查和认定。

2.2.5 洗片人负责清洗镜检过的没有发现微粒子孢子的样片。用清水将镜检过的载玻片和盖玻片清洗干净并晾干后以备继续使用。当天镜检过的样片要当天清洗出来，同时负责对镜检室的卫生清理工作。

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（3）区分核算对象。医疗服务项目和各种科研项目都是医院成本核算的对象。其中，医疗服务项目通常按临床诊疗类、综合医疗服务类、中医及其他诊疗类、医技诊疗类等类别来区分，而科研项目的区分依据则应该是项目的名称。

5 “带毒”母蛾卵、样片的处理及注意事项

5.1 柞蚕微粒子病蛾卵的处理

镜检员镜检过程中要把装有“带毒”的卵袋进行统一保管，等到当天镜检全部结束后，要负责处理当天镜检“带毒”的卵。用纸袋作产卵袋的将纸袋与卵一同烧毁;用塑料纱袋作产卵袋的将“带毒”病卵剥下后烧毁，消灭病原。

5.2 “带毒”样片的处理

镜检员在镜检过程中要把带有微粒子孢子的样片进行统一保管，如果载玻片数量充足，最好将“带毒”样片在制种镜检全部结束后，统一用1%氢氧化钠溶液消毒清洗;如果载玻片数量不充足，又急需载玻片时，则在当天镜检结束后，将“带毒”样片用1%氢氧化钠溶液消毒清洗凉干后备用。每天镜检结束后都要对镜检室进行卫生清扫，保持良好的镜检环境。