薄层色谱生物自显影法筛选新疆莫合烟天然乙酰胆碱酯酶抑制剂的活性成分＊

王 健，朱萍萍，倪国柱，温琳豫，支 玲，胡曙晨

(新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011)

吸烟有害健康，戒烟是世界趋势。一般都认为，烟碱是烟草中的主要毒性物质，但流行病学研究报告显示，吸烟可降低阿尔茨海默病(AD)和帕金森综合征(PD)的发病率。一些试验和临床研究结果也显示，烟碱可预防并治疗AD 和PD，这引起了人们的广泛重视[1-3]。AD 的发病机制目前尚不明确，但获得最广泛支持的胆碱能学说和β-淀粉样蛋白学说都表明，乙酰胆碱酯酶(AChE)和AD 的形成密切相关，会从多方面加重AD 患者的症状。目前，抑制AChE 活性从而间接增强胆碱能活性，仍然是治疗AD 最有效的方法。现阶段寻找天然的乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)多采用先分离后测定活性的方法。按照传统方法，从提取植物浸膏到分离出化合物并解析出正确的化学结构，往往耗费数月甚至数年。因此，建立更快捷、更准确的天然AChEI 跟踪分离方法成为国内外学者的研究目标。近年来，薄层色谱生物自显影技术逐渐被用于天然AChEI 的跟踪分离[4-5]。虽然烟草中的烟碱用于预防和治疗AD 的机理尚未完全阐明，且学术界对是否能使用烟碱治疗AD 存在争议，但笔者认为，仍有必要通过薄层色谱生物自显影技术分离新疆莫合烟中天然AChEI，探明其中是否存在这些成分，从而为后期的开发研究奠定试验基础。

1 仪器与试药

仪器:KQ-500DE 型超声波清洗器(500 W，40 kHZ，昆山市超声仪器有限公司);半自动点样仪(CAMAG Linomat 5);薄层色谱数码成像仪(CAMAG REPOSTAR3);台式离心机(Thermo Scientific Multifuge X3R);分析天平(Mettler -Teledo AB135 -S，d=0.01/0.1 mg);磁力搅拌油浴槽(东京理化EYELA PS-1000);旋转蒸发仪[EYELA N-1001S-WA(D)];pH 计(Sartorius PB-10);硅胶G 高效板(青岛海洋化工厂);双槽展开缸(20 cm×10 cm)。

试药:2，2 -二苯基苦基苯肼自由基(2，2-Diphenyl-1 -picrylhydrazyl，DPPH，批号为STBC1252V，ALDRICH 公司);乙酰胆碱酯酶(AChE，Sigma 公司，批号为041M7009V);固蓝盐B(中国医药＜集团＞上海化学试剂公司);三羟基氨基甲烷(Tris，批号为110108)，牛血清白蛋白(BSA，批号为110913)，均为上海蓝季科技发展公司产品;乙酸-α-萘酯(AR，天津市光复精化工研究所);无水碳酸钠(AR，天津市盛奥化学试剂有限公司);甲苯(AR)，甲醇(AR)，醋酸乙酯(AR)，二乙胺(AR)，均为天津福晨精细化工有限公司产品;无水乙醇(AR，天津市登科化学试剂有限公司);氯仿(AR，天津市富宇精细化工有限公司);浓氨水(AR)，浓硫酸(AR，98%)，均为成都市科龙化工试剂厂产品。新疆莫合烟原产自新疆伊犁地区，2010 年购买于乌鲁木齐市场。烟碱(批号为20110515，纯度大于98%，上海源叶生物科技有限公司);石杉碱甲(批号为20110411，上海源叶生物科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1 莫合烟提取液制备

用1%的稀硫酸以料液比1 ∶6 和1 ∶5 分别对新疆莫合烟水浴回流1 h，合并2 次提取液于蒸发皿中，50 ℃水浴蒸干，制成粗浸膏，取200 mg 浸膏，溶于1 mL 甲醇中，配制成质量浓度为200 g/L 的莫合烟水提取液，备用[6]。取新疆莫合烟20 g，加入甲醇100 mL 和10% 无水Na2CO320 mL，水浴回流10 min 后，在45 ℃下旋转蒸发至移出液体体积的1 /10，离心后取上清液，得到莫合烟醇提取液Ⅰ。再分别取醇提液Ⅰ2，4，8 mL，置3 个10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，离心后取上清液，得到莫合烟醇提取液Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ[7]。

2.2 溶液配制

对照品溶液:精密称取石杉碱甲对照品2 mg，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得对照品溶液(质量浓度为0.2 g/L)。精密称取烟碱对照品200 mg，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得对照品溶液(质量浓度为20 g/L)。

乙酰胆碱酯酶溶液[4]:取乙酰胆碱酯酶AChE 500 U 溶解于Tris-HCl 缓冲液(pH=7.8)500 mL 中，加入牛血清白蛋白(BSA)500 mg 以保持酶溶液的稳定，得1.0 U/mL 的乙酰胆碱酯酶溶液。此溶液可在4 ℃保持活性达6 个月。

显色剂[4]:精密称取乙酸-α-萘酯150 mg，置100 mL 容量瓶中，加40 mL 无水乙醇溶解，加蒸馏水稀释至刻度，制成质量浓度为1.5 g/L 的乙酸-α-萘酯溶液。精密称取固蓝盐B 50 mL，置100 mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容，制成质量浓度为0.5 g/L的固蓝盐B 溶液。

DPPH 溶液[8]:精密称取DPPH 7.78 mg，用甲醇定容于100 mL 容量瓶中，制成DPPH 溶液(质量浓度为0.2 mmol/L)，避光(0 ～4 ℃)保存。

2.3 展开与显色

抗乙酰胆碱酯酶薄层色谱自显影法[4，9]:分别吸取石杉碱甲对照品溶液3 μL，莫合烟水提取液5 μL 和10 μL，烟碱对照品0.9 μL，点于同一高效G 板上。以乙酸乙酯-甲醇-浓氨水(7 ∶3 ∶0.1)为展开系统，展开后用吹风机将板子完全吹干，不能残留任何有机溶剂。喷1.0 U/mL 的乙酰胆碱酯酶溶液，冷风快速吹至板子上无液体流动，再喷40%乙醇配制的乙酸-α-萘酯溶液(1.5 g/L)，也快速吹至板子上无浮液。在37 ℃恒温水浴锅中放一小铁架，将板子架在架子上，不接触到水，然后将皿盖盖好，温热20 min 后取出板子，喷固蓝盐B 溶液(0.5 g/L)。如果样品有乙酰胆碱酯酶抑制活性，即可观察到紫色背景下有白色的抑制剂斑点。分别记录薄层板显色前后自然光、紫外光254 nm、紫外光366 nm 波长下的照片，见图1。

图1 抗乙酰胆碱酯酶薄层色谱生物自显影图

图2 DPPH 显色法薄层色谱图

DPPH 显色法:分别吸取莫合烟醇提取液Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅰ各10 μL，石杉碱甲对照品溶液3 μL，点于同一高效G 板上。以甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(7 ∶2 ∶1)为展开系统，展开后喷0.2 mmol/L DPPH 溶液显色。如果存在抗氧化活性，可在淡紫色背景下看到白色至黄色斑点。分别记录薄层板显色前后自然光下照片，见图2。

2.4 试验结果

笔者之前的试验研究测得，莫合烟中总生物碱含量为1.71%[8]。通过对比抗乙酰胆碱酯酶薄层色谱自显影法中紫色背景下白色斑点的大小，证实烟碱可与抗乙酰胆碱酯酶结合并降低其活性;但在莫合烟提取液中与烟碱对照品相应位置处没有出现抗乙酰胆碱酯酶的显著白色斑点，加大点样液质量浓度或点样量也无改善，证实莫合烟提取液中的烟碱含量无法达到显著的抑制浓度，较石杉碱甲对照品活性偏低。通过DPPH 显色法点样展开，发现莫合烟提取液抗氧化活性较好，清除DPPH 的白色至黄色抗氧化斑点随提取液质量浓度加大而加大;同时发现，莫合烟提取液中不只一种成分具有较显著的抗氧化活性。

3 讨论

烟碱作为N 胆碱受体激动剂的代表，小剂量激动受体，大剂量阻断受体[10]，是公认的烟草致瘾并导致其戒除困难的元凶，但烟碱在长期吸烟者身上也表现出了降低退行性疾病发病率的作用。首先，烟碱容易进入中枢系统，通过兴奋nAChR 增加多巴胺、乙酰胆碱等神经递质的释放，并通过α4β2nAChRs 和PI3K-Akt通路对中枢神经元产生保护作用，免受兴奋性氨基酸谷氨酸产生的神经毒性毒害[11];其次，烟碱进入中枢后，可与乙酰胆碱酯酶结合而降低脑内的乙酰胆碱酯酶水平，从而对记忆和学习功能有所改善;另外，烟草中存在的抗氧化物质可能也会对预防退行性疾病产生作用[12]。

由于上述或其他还未阐明的原因，长期吸烟者退行性疾病的发病概率低于不吸烟者的现象能够得到解释。但烟草未经点燃与点燃吸入，内含物的结构与形态会发生变化，烟草实际的烟碱含量、烟草提取物(液)中的烟碱含量及吸入人体后的烟碱含量，甚至短期吸入与长期吸入的烟碱含量必然存在差异，其量效关系需要严格的药理学试验进行证实。本研究中所确立的薄层色谱生物自显影方法，可在大规模动物试验前筛选各类烟草及烟草制品，通过白色斑点的有无、白色斑点的深浅，高灵敏度和专属性地定性烟碱含量是否达到显著抑制乙酰胆碱酯酶的水平，从而为进一步的研究奠定基础。薄层色谱生物自显影作为一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的药物筛选方法，是一种快速测定方法，应用于天然AChEI 的筛选，值得推广。

同时，如何协调烟碱成瘾与阻断乙酰胆碱酯酶受体的剂量，如何以烟碱为母体对其系列衍生物进行抗乙酰胆碱酯酶作用机制的研究，并且最终在烟碱替代疗法中达到戒烟与预防退行性疾病共赢的目标，可以为我国烟草行业的发展提供一个有益的思路，探求新的发展机遇。

通过薄层色谱生物自显影方法对新疆莫合烟进行活性筛选发现，莫合烟中的烟碱具有抗乙酰胆碱酯酶活性，但提取液中的烟碱含量达不到显著抑制浓度;莫合烟提取液的抗氧化活性较强;薄层色谱生物自显影是值得推广，可应用于天然AChEI 活性筛选的技术。因此，将薄层色谱生物自显影技术广泛应用于烟草、烟草制品及其他潜在药物的抗乙酰胆碱酯酶活性的体外筛选，是进行大规模动物试验前的一个有益尝试。

致谢:本研究得到了新疆医科大学分析测试中心主任李新霞教授的悉心指导。

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