醒脑丸对气虚血瘀血管性痴呆大鼠的治疗作用研究

徐海蓉

(中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

血管性痴呆(VD)是脑血管病(CVD)后发生的进行性智能障碍综合征，发病率各国报道不一致，在老年痴呆中欧美占15% ～50%，亚洲占60% ～80%[1]。我国11 个城市和农村普查结果显示，大于60 岁人群的患病率为324/10 万，城市人群为428/10 万，农村人群为140/10 万[2]。血管性痴呆的发病率与年龄呈正相关，其中大于60 岁者占79.53%[3]，25% ～50%的脑血管病最终导致血管性痴呆。脑梗死痴呆发生率为13.6%，大于出血性痴呆的2.69%，其中多发梗死性痴呆(MID)占15% ～68.7%[4]。虽然现代医学对血管性痴呆的病因病理认识已比较明确，但尚无特效的治疗方法，而中医复方具有整体调节，多层次、多方位、多靶点作用，毒副作用小等特点。为此，本研究中初步探讨了中药醒脑丸对血管性痴呆的治疗作用及机理。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级SD 大鼠48 只，雄性，体重(200 ±20)g，由南京君科生物科技有限公司提供，符合国际动物伦理学标准。醒脑丸(哈药集团世一堂制药厂，国药准字Z23020166，规格为每丸9 g)主要由黄芪、西洋参、当归、川芎、水蛭、地龙、三七、菖蒲、远志、冰片等组方，将药丸溶解、过滤至含生药1 g/mL，置冰箱备用;脑复康片(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，国药准字H21021775，规格为每片0.4 g)，将药片溶解制成0.032 g/mL 混悬液备用。大鼠血栓素B2(TXB2)ELISA 试剂盒(上海科敏生物科技有限公司);总一氧化氮(NO)试剂盒(碧云天生物研究所);大鼠Bax 免疫组化试剂盒(上海信裕生物科技有限公司)

1.2 方法

动物前期准备:大鼠购回后适应性喂养3 d，进行24 h 饮水量、24 h 食量、自发活动的测定。自发活动量化测定方法[5]，将自制的25 cm×25 cm×25 cm 的自发活动箱底部划十字线，分为4等份，置安静环境中，试验前先抚摩动物2 min，使其熟悉试验者，然后将大鼠置测定箱的一角，观察3 min 内动物横向和直向活动，以跨越划线次数为横向活动指标，以前肢抬起或后肢站立的次数为直向活动指标。第4 天开始，进行游泳劳损引起气虚造模。14 d 后，再进行24 h 饮水量、24 h 食量、自发活动的测定。

造模:游泳劳损致气虚模型，将大鼠放入水温(43 ±0.5)℃、水深35 cm 的恒温水槽中游泳，连续游泳14 d;以每只大鼠出现自然沉降的时间为大鼠游泳耐疲劳的时间，当全组50%的大鼠出现自然沉降时，全组动物停止游泳。全脑缺血模型，大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉(每100 g 体重0.3 mL)，仰卧位固定，颈正中去毛，碘酒酒精消毒，行颈正中切口，钝性分离肌肉及皮下组织，分别暴露双侧颈总动脉并用丝线结扎，逐层缝合，对齐皮肤;术后给予青霉素20 万U 肌肉注射3 d，注意保持伤口清洁，分笼饲养。

分组:将气虚造模成功的大鼠随机分为4 组，即空白对照组(A 组)、模型组(B 组)、脑复康片组(C 组)、醒脑丸组(D 组)，每组12 只。

给药:术后3 d，大鼠伤口愈合，饮食恢复后开始给药，4 组均连续灌胃15 d，每天早晚各1 次。

A 组、B 组均以每次3 mL 生理盐水灌胃，C 组以每次每1 kg体重脑复康片83 mg 溶于3 mL 生理盐水中灌胃，D 组以每次每1 kg 体重醒脑丸0.83 g 体重溶于3 mL 生理盐水中灌胃。

1.3 观察指标

行为学指标:观察大鼠造模及用药后的机体状态，如皮毛、活动量、舌质;大鼠学习获得能力测试，术后21 d 时，4 组大鼠分别进行水迷宫试验，水迷宫由中国医学科学院药物研究所研制，整个迷路设置4 个盲端，终点有一高出水面的安全台，水深18 cm，水温(25±2)℃;每天训练2 次，记录每只大鼠在游泳中进入盲端的次数及游出时间，在水迷宫中进入盲端的次数越少及游出的时间越短，表明动物学习记忆能力越强。采用ELISA 法检测血浆TXB2含量，用硝酸还原酶法测定10%脑匀浆中NO 含量，光镜下观察海马CA1 区神经元形态、数量，采用免疫组化法检测大脑海马促细胞凋亡蛋白Bax 表达。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 气虚模型

与造模前比较，造模后大鼠24 h 饮水量、食量均明显减少，自发活动量也降低，均有极显著性差异(P ＜0.01)，提示游泳劳损致气虚造模成功。见表1。

2.2 大鼠机体状态比较

灌服药物15 d 后观察大鼠，A 组活动灵活，皮毛鲜亮有光泽，舌质淡红;B 组自主活动减少，皮毛色黯不光滑，舌质紫黯;C 组自主活动有所增多，但皮毛色泽与舌质颜色与B 组基本相同;D组自主活动明显增多(接近A 组)，皮毛光滑柔顺、色泽鲜亮(与A组无明显差异)，舌质较红。

表1 气虚模型评定结果( ± s)

表1 气虚模型评定结果( ± s)

注:与造模前比较，＊P ＜0.01。

类别造模前(n=48)造模后(n=48)24 h 饮水量(mL)13.97 ±1.76 10.29 ±1.05＊24 h 食量(g)9.30 ±2.06 7.15 ±1.31＊自发活动(次)26.23 ±7.07 21.77 ±6.65＊

2.3 观察指标测定

学习获得能力:与A 组比较，B 组水迷宫到达终点时间明显延长，进入盲端的错误次数明显增多，学习能力下降，均有极显著性差异(P ＜0.01)，提示痴呆模型造模成功。与B 组比较，C 组和D 组到达终点时间均明显缩短(P ＜0.01)，D 组进入盲端的错误次数明显减少(P ＜0.01)，提示中药醒脑丸可提高血管性痴呆大鼠的学习获得能力。见表2。

血浆TXB2含量:与A 组比较，B 组血浆TXB2含量明显升高(P ＜0.01)，提示气虚血瘀征象明显，造模基本成功。与B 组比较，C 组血浆TXB2含量无明显变化(P ＞0.05)，D 组则明显降低(P ＜0.05)，提示醒脑丸可降低血管性痴呆大鼠TXB2含量，稳定血小板功能，改善气虚血瘀征象。见表2。

脑组织NO 含量:与A 组比较，B 组脑组织NO 含量明显升高(P ＜0.01)，提示造模基本成功。与B 组比较，C 组和D 组脑组织NO 含量均降低，D 组降低更明显(P ＜0.01)，提示醒脑丸可降低血管性痴呆大鼠脑组织NO 含量，减少过量NO 的毒性作用，减轻脑缺血后期神经元的损害。见表2。

表2 各组大鼠观察指标测定结果( ± s，n=9)

表2 各组大鼠观察指标测定结果( ± s，n=9)

注:与A 组比较，＊P ＜0.01;与B 组比较，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

组别 学习获得能力 血浆TXB2 含量(pg/mL)脑组织NO 含量(μmol/L)A 组B 组C 组D 组到达终点时间(s)62.75±15.94 132.00±30.38＊66.50±16.20▲65.75±20.01▲错误次数(次)1.38±1.06 3.88±1.13＊2.50±1.07△1.63±0.92▲708.21±250.90 1 185.02±198.63＊1 058.22±329.44 872.13±211.25△5.56±1.32 9.08±2.30＊6.46±1.22△6.00±1.75▲

2.4 海马CA1 区神经元形态学观察

A 组海马CA1 区结构完整，神经元形态、数目正常，锥体细胞排列整齐;B 组海马CA1 区结构不完整，锥体细胞排列紊乱，神经元数目明显减少，部分细胞周围出现间隙，细胞脱失明显，胶质细胞大量增生形成结节;C 组海马CA1 区结构欠完整，锥体细胞排列不整齐，神经元数目减少，但较B 组多，细胞有脱失，胶质细胞增生明显;D 组海马CA1 区结构较完整，锥体细胞排列基本整齐，神经元数目较B 组增多，细胞脱失较少，胶质细胞轻度增生。见图1。结果提示，醒脑丸对海马CA1 区神经元的损伤有保护作用。

2.5 大脑海马促细胞凋亡蛋白Bax 的表达

Bax 免疫阳性细胞呈黄褐色，未加Bax 抗体的阴性对照为淡蓝色。在A 组中，非缺血大鼠的海马区极少见Bax 免疫阳性细胞，仅存在于个别皮层区域，且从形态学上看出，此表达局限于锥体细胞和中间神经元中。而在B 组中，可发现海马CA1 及CA4 区出现明显的Bax 免疫阳性反应;脑皮层也呈现与海马区类似的Bax免疫阳性反应，呈散在较均匀地分布。C 组Bax 的表达较B 组有一定减少。D 组Bax 的表达明显减少，特别是海马CA1 区及大脑皮层区。见图1。结果提示，醒脑丸能下调脑缺血后Bax的表达，从而发挥其抗细胞凋亡的神经保护作用。

图1 各组大鼠海马CA1 区神经元形态学光镜图

3 讨论

中医对痴呆的认识，早在先秦时期《左传》中就有“不慧，盖世所谓白痴”的记载，汉代华佗始称之为“痴呆”，此后亦有愚痴、痴证、呆痴、呆病、神呆等不同名称[6]。其成因在《医林改错》中已有“灵机记性在脑，年高无记性者，脑髓渐空”的概述，并说明痴呆与脑髓充盈的程度有直接关系，即脑髓充盈则人的脑神具有灵性智慧，神机聪颖，否则神机衰退以至不慧而成痴呆。

中风痴呆是痴呆的一个重要类型，其发病于中风之后，出现“迷惑善忘”“言善误”“语无伦次”“懈怠安卧”“苦忧悲”等一系列精神异常症状。《金匮要略·中风历节病》:“邪入于腑，即不识人。”《临证指南医案·中风》:“或风阳上僭，痰火阻窍，神识不清……”，均明言中风时神志受累之实[7]。中风痴呆的发病机制，不可脱离“年老体衰”“发于中风”这两个特点。

血管性痴呆的发生与脑动脉硬化、颈内动脉闭塞及基底动脉硬化关系密切[8]。本病病因为内有所伤，外有所扰。人至老年，体力渐衰，五脏皆虚，尤其是心、肾、脾、胃等脏气亏虚，则脑髓渐空，复因将息失宜、烦劳过度等，致使人体阴阳失调、气虚血瘀、脑络不通、脑脉失养、神明失用，遂痴呆、善忘。病性为本虚标实，五脏气虚为本，瘀血闭阻脑脉为标，虚瘀并见，以益气养血、活血化瘀为其治疗的有效方法。

醒脑丸方中，黄芪大补元气，使气旺以促血行，祛瘀而不伤正;西洋参助黄芪补气，有人参之功，无温燥之弊，补气而不伤阴，与黄芪共为君药;当归为臣，能补血又能行血，可攻可补，有祛瘀而不伤好血之妙;川芎、三七活血化瘀，地龙通络之功无处不到，水蛭性寒、入血分而长于逐瘀、性迟缓则不伤正气，菖蒲、远志化痰开窍、安神益智，共为佐药;冰片为使，香窜善行，通诸窍更能清心醒脑。全方构思周密、精巧，共奏益气活血开窍之功[9]。

现代药理研究证明[10]，黄芪能加强学习记忆能力，有利于大脑对信息的贮存作用。黄芪总黄酮可降低细胞脂质过氧化物的生成，升高细胞超过氧化物歧化酶(SOD)的活性，维持细胞正常代谢。西洋参可调节大脑皮层的兴奋、抑制过程，西洋参茎叶皂苷能增加循环血容量，减少休克时去甲肾上腺素的合成和释放，从而改善微循环的灌流状态，显示出良好的全身性抗缺氧作用。当归能明显改善大鼠试验性脑缺血症状，抑制TXB2产生，纠正脑缺血血检素A2/前列环素I2(TXA2/PGI2)比值，对急性脑缺血大鼠具有明显的治疗作用。当归、黄芪均能抑制大鼠血小板聚集，二者合用时作用更强，具明显的协同作用。川芎嗪可通过血脑屏障，能抗血栓形成，显著减轻兔脑组织缺血性损害和神经系统功能障碍。水蛭可明显增加脑血流量，给试验性脑水肿的家兔静脉注射水蛭水提醇沉液，可减少脑切片的血肿面积、促进脑血肿吸收。地龙提取液能明显延长血小板血栓和纤维蛋白血栓的形成时间，减少血栓长度和干重。三七能抑制血小板聚集，降低血液黏度，能阻止再灌注时Ca2+内流，对脑缺血损伤起保护作用。三七茎叶皂苷能提高脑组织SOD 活性，起到抗衰老作用。菖蒲水、醇提取物对中枢神经系统有镇静作用，并能明显促进正常小鼠的记忆获得，并可对抗亚硝酸钠或乙醇对记忆的不良作用。

本研究结果表明，醒脑丸能有效抑制脑缺血时体内血小板的激活，降低血浆TXB2的水平，减轻微循环障碍，提示醒脑丸对缺血性脑血管病具有积极的防治作用，对气虚血瘀的病理状态有明显改善作用。同时，醒脑丸可降低血管性痴呆大鼠脑组织NO 含量，减少过量NO 的毒性作用，减轻脑缺血后期神经元的损害，这可能是醒脑丸治疗血管性痴呆的作用机理之一。

本研究中，血管性痴呆大鼠脑切片用HE 染色后，光镜结果证实了缺血对海马的损伤，也表明了醒脑丸对血管性痴呆大鼠海马CA1 区神经元的缺血性损伤具有保护作用，这可能是该药治疗血管性痴呆的主要作用机制之一。采用免疫组织化学方法研究发现，应用醒脑丸后，Bax 免疫阳性细胞数目明显减少，证实醒脑丸能下调脑缺血后Bax 蛋白的表达，从而发挥其抗细胞凋亡的神经保护作用。但关于醒脑丸对缺血后脑细胞中Bax 的表达发挥调节作用的确切机制尚待进一步研究。

[1] 张 楠. 血管性痴呆的治疗进展[J]. 中国全科医学，2013，16(36):4 239 -4 241.

[2] 孙乐羽，李 昕，牛延良，等. 丁苯酞软胶囊治疗血管性痴呆的临床疗效[J]. 中国老年学杂志，2013，33(16):3 967 -3 969.

[3] 高 康，张庆萍，李 飞，等. 血管性痴呆早期诊断方法的应用进展[J].山东医药，2012，52(26):90 -92.

[4] 韩 颖，崔 鹏，王娇兰，等. 不同治疗方法对血管性痴呆患者认知功能的影响[J]. 中国老年学杂志，2013，33(11):2 509 -2 511.

[5] 卢昌均，韦冰心，安红伟，等. 血管性痴呆模型大鼠空间记忆障碍与海马CA1 区神经元凋亡和乙酰胆碱释放有关[J]. 国际脑血管病杂志，2013，21(12):898 -902.

[6] 李四方. 辨证治疗脑梗死后血管性痴呆临床观察[J]. 光明中医，2013，28(4):709 -710.

[7] 徐明雅，周 俊，王绥勤. 血管性痴呆患者中医证型与血浆同型半胱氨酸水平的相关性[J]. 中国老年学杂志，2013，33(11):2 645-2 646.

[8] 娄武涛，徐 进，盛恒松，等. 血管性痴呆患者脑电信号的多通道线性描述符特征研究[J]. 西安交通大学学报，2011，45(4):121 -125.

[9] 韩 飞，荆志伟，于亚南，等. 中药有效成分治疗血管性痴呆的研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18(7):273 -276.

[10] 王 辉，张选国. 醒脑丸对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及脑组织钙离子含量的影响[J]. 陕西中医，2012，33(10):1 421 -1 423.