高盐辣椒发酵过程中主要成分及风味的变化

欧阳晶，陶湘林，李梓铭，李云倩，蒋立文*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；3.湖南省发酵食品工程技术研究中心，湖南 长沙 410128）

高盐辣椒发酵过程中主要成分及风味的变化

欧阳晶1,2，陶湘林1,2，李梓铭1,2，李云倩1,2，蒋立文2,3,*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；3.湖南省发酵食品工程技术研究中心，湖南 长沙 410128）

以辣椒为原料、以高盐辣椒发酵过程为研究对象，测定在不同发酵时段的辣椒总酸含量与亚硝酸盐总量，利用固相微萃取技术和气相色谱-质谱联用技术测定不同发酵时间高盐辣椒中的挥发性成分，并利用主成分分析法与聚类分析法对挥发性成分进行评价。结果表明：酸度在发酵阶段变化不大，亚硝酸盐含量在全过程中未超过国家标准，共鉴定出包括烯烃类（4种）、芳香族类（9种）、醇类（13种）、醛类（7种）、酮类（3种）、酸类（2种）、酯类（18种）等7类化合物。随着发酵的进行，初始阶段辣椒中的醇类、酸类与酯类成分含量有所增加，而后醇类与酯类成分含量继续增加，而酸类减少，最终各类成分含量更为均衡。主成分分析得出22种主要的挥发性成分。在整个发酵过程的第24天时的样品风味最为协调。

高盐辣椒发酵；挥发性成分；固相微萃取与气相色谱-质谱联用；主成分分析；聚类分析

发酵辣椒又名剁辣椒，是一种香味独特、美味可口、开胃保健的传统调味品[1]，具有抗血栓[2]、消炎镇痛[3]、抗氧化[4]、减肥[5]等功效。利用乳酸菌的高耐盐性，现代工业制作发酵辣椒常在原料辣椒中加入大于18%的盐进行盐醅发酵，然后直接包装或脱盐调味制成成品[6]。此法制成的辣椒不仅能保留其色泽、辣味和脆度，还能有效的抑制杂菌的繁殖、延长产品的保质期，保证大批量生产产品质量的稳定。但传统高盐发酵辣椒的发酵时间长、风味形成慢、味道欠佳[7]。理化指标与挥发性成分是剁辣椒产品质量与风味的重要指标，探索剁辣椒高盐发酵过程中酸度、亚硝酸盐含量与挥发性成分旨在监测辣椒发酵过程中主要成分与风味物质的变化。

本研究利用酸碱滴定法、分光光度计法与固相微萃取法和气相色谱-质谱联用技术（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPMEGC-MS）对高盐发酵过程中辣椒的酸度、亚硝酸盐含量与挥发性成分进行了测定，并利用SPSS软件对挥发性成分进行主成分分析（principal components analysis，PCA）与聚类分析（cluster analysis，CA），以期为发酵辣椒的工艺优化、品质保证与风味调控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

坛坛香4号红线椒，产地湖南，购买于湖南农业大学东之源超市。

亚铁氰化钾、乙酸锌、四硼酸钠、4-氨基苯磺酸、N-1-萘乙二胺盐酸盐、亚硝酸钠（均为分析级） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

固相微萃取装置（配有手动固相微萃取进样器、50/30 øm DVB/CAR/PDMS萃取头、20 mL顶空钳口样品瓶） 美国Supelco公司；GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；GL-3250磁力搅拌器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；7200可见分光光度计上海尤尼科仪器有限公司；SW-CJ净化工作台 上海新苗医疗器械制造有限公司；CP214分析天平 上海奥豪斯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高盐辣椒的制备

挑选新鲜、成熟、无损、无虫害的红线椒，洗净、去蒂并沥干，其后用刀将辣椒切成1 cm²的小块，加入23%（m/m）的食盐、2%（m/m）的白酒，拌均后入坛，进行室温发酵，并在设定时间进行取样。

1.3.2 高盐辣椒酸度、亚硝酸盐含量以及挥发性成分的测定

测定发酵第0、6、12、18、24、30天的高盐辣椒中酸度、亚硝酸盐含量与发酵第0、8、16、24、32天挥发性气味物质。

利用GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》[8]中的酸碱滴定法测定高盐辣椒中总酸含量；利用GB/T 5009.33—2010《食品中亚硝酸盐的测定》[9]中的分光光度计法测定高盐辣椒中亚硝酸盐含量；利用固相微萃取法和气相色谱-质谱联用技术测定高盐辣椒中挥发性成分。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：DB-5ms毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 øm）；升温程序：初温40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min升至150 ℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min，再以20 ℃/min升至270 ℃，保持1 min；进样口温度250 ℃；载气为He；流量1.0 mL/min。

1.3.4 质谱条件

电子电离离子源；离子源温度200 ℃；电离能量70 eV；灯丝电流150 μA；扫描质量范围m/z 33～500。

1.4 数据处理

利用随机NIST 2002标准谱库检索分析，参考文献[1,10-11]对机检结果进行核对和确认；采用峰面积归一化法求各成分的相对含量。

得到的挥发性气味物质采用SPSS软件进行主成分与聚类分析。

2 结果与分析

2.1 高盐辣椒发酵过程中总酸与亚硝酸盐含量的变化

发酵第0、6、12、18、24、30天的高盐辣椒总酸与亚硝酸盐含量见图1。

图1 辣椒发酵过程中总酸与亚硝酸盐含量的变化Fig.1 Changes in total acid and nitrite contents during chili fermentation

由图1可知，辣椒发酵前期总酸含量较为平稳，发酵第6天达到最大，发酵第30天较前有较大的减小。总酸含量是影响辣椒风味的重要指标[12]，由于发酵过程中盐含量较高，抑制了产酸微生物的生长，所以前期总酸主要依靠辣椒本身的营养物质分解产生；发酵后期体系中的酵母菌、丁酸菌等微生物数量增多并分解有机酸[13]或辣椒中的各类物质与酸发生反应都可能是后期总酸含量下降的原因。

辣椒本身含有一定量的亚硝酸盐，在发酵前期其亚硝酸盐的含量接近线性增加，发酵第24天达到峰值，随后减少。高盐环境抑制了微生物生长从而降低了亚硝酸盐含量的增长。亚硝酸盐是强致癌物，在酱腌菜中的限量为20 mg/kg[14-15]，在发酵周期内样品的亚硝酸盐含量均未超过限定值，但应尽量避免亚硝酸盐含量较高时期食用。

2.2 高盐发酵辣椒过程中挥发性成分的变化

发酵第0、8、16、24、32天的高盐辣椒的挥发性成分质谱图见图2。

辣椒发酵过程中共检出56种挥发性气味物质，其中醇类化合物13种、醛类化合物7种、酯类化合物18种、烯烃类化合物4种、芳香族类化合物9种、酸类化合物2种、酮类化合物3种。

图2 发酵辣椒中挥发性物质的总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatograms of volatile compounds during chili fermentation

发酵第0、8、16、24、32天的高盐辣椒挥发性成分测定结果分析如表1。

表1 辣椒发酵过程中挥发性风味成分变化Table 1 Changes in volatile compounds during chili fermentation

续表1

未发酵的辣椒挥发性风味物质以醇类与醛类为主，酯类、烯烃烷烃类、芳香族类、酮类次之，酸类最少。发酵第8天的辣椒酯类、醇类、酸类的相对含量有较大的增加，醛类、芳香族类、酮类物质含量大幅减少。微生物分解或自然挥发可能是导致各大类风味物质均有所损失的原因；醇类物质相对含量增加可能是发酵过程中酵母菌与乳酸菌等微生物代谢的结果；酸类物质的增加可能还与蛋白质分解成氨基酸有关；酸类和醇类物质发生酯化反应随着发酵的进行酯类物质逐渐增加[16]。酸类在发酵第16天后未检出；醇类在发酵第16天达到相对含量最大，其他物质变化不大。随着发酵的进行，酯化反应仍在继续。醇类、酸类物质达到最高值后均有减少，这种现象可能与相关微生物代谢受到抑制有关，同时脂类、糖类、蛋白质的自身水解的产物或微生物代谢产物之间相互作用生成各类香气物质使得发酵辣椒的风味更加丰富、柔和[13]。

发酵辣椒在不同发酵时间内的挥发性成分的数据离散，单一利用种类与相对含量难以说明其对发酵辣椒风味的贡献，因此选取辣椒在不同发酵阶段的挥发性气味成分作为变量，进行主成分分析与聚类分析[17]。

表2 主成分的特征值以及贡献率Table 2 Eigen values and contribution rates of principal components

累计贡献率表示主成分所占全部变量信息量的比例，由表2可知，前2个主成分贡献率达85.904%，说明主成分1与主成分2已能够较为客观的反映辣椒发酵过程中挥发性物质的变化趋势，故选取前2个主成分进行分析。

主成分所包含的因子的载荷系数综合反映了辣椒中各挥发性气味物质对各主成分的影响，初始因子负荷矩阵负荷越大，说明主成分对该变量的代表性越强[18-19]。从表3可以看出，（Z）-橙花叔醇、反式-4-癸烯酸乙酯、D-柠檬烯、癸醛、2,6,6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮、橙花醇、水杨酸甲酯、角鲨烯、己酸己酯、正己醇、壬酸乙酯、2-己酸乙酯、己酸异丁酯与主成分1高度正相关，异戊醇、乙酸异戊酯、3-甲基-4-羰基戊酸、甲氧基-苯基-肟与主成分1呈高度负相关；苯乙醇、丁酸己酯、（S）-2-羟基-丙酸乙酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、丁子香烯、2-甲氧基-3-（2-甲基）-吡嗪、甘菊环与主成分2呈高度正相关，2-甲氧基-3-异丙基吡嗪、丁酸乙酯与主成分2呈高度负相关。而总方差85%以上的贡献来自第1和第2主成分，所以可以认为以上各物质为辣椒发酵过程中主要的风味物质。

主要风味物质中醇类占5种，醇类常赋予产品新鲜的气味，也是生成重要的风味物质酯类的主要来源，其中（Z）-橙花叔醇、橙花醇与苯乙醇具有令人愉悦的玫瑰香气，正己醇具有水果芬芳香气，异戊醇具有苹果白兰地香气和辛辣味。醛类占1种，其阈值较低，赋予香气的能力较强，癸醛具有甜橙和橘子香气。酯类占17种，是辣椒发酵后期由酸和醇酯化而成的主要的呈味物质，通常具有酒香与新鲜的水果、青草香味，但其中水杨酸甲酯具有香脂、冬青样香气；乙酸异成酯具有强烈的香蕉、生梨、苹果的甜水果香气，并带有梨的甜酸味；周晓媛等[1]在自然发酵辣椒中也检出了类似的气味物质。烯烃类占4种，其阈值一般较高，对风味的贡献较小，其中角鲨烯呈脂类香味，D-柠檬烯具有类似柠檬的香味[20]，丁子香烯具有温和的丁香香气，具有解痉作用[21]。芳香族类、酸类、酚类和酮类化合物占12种，其中甘菊环具有香樟木气味，是番石榴的主要挥发性成分[22]。甲基庚烯酮具有新鲜的青香、柑橘样气息，2,6,6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮具有茶香，2-甲氧基-3-异丙基吡嗪与2-甲氧基-3-（2-甲基）-吡嗪具有坚果香、花生香、霉味和面包香[23]，这些物质均为发酵辣椒重要的风味组分。

表3 主成分载荷矩阵Table 3 Loading matrix of principal components

表4 标准化后主成分得分Table 4 Standardized principal component scores

图3 主成分投影图Fig.3 Axonometric drawing of principal components

将各特征向量数据中心化和标准化后，各主成分得分如表4所示。以主成分2得分为X轴，主成分1得分为Y轴作主成分投影图（图3）。将发酵过程中挥发性成分进行聚类分析，结果如图4所示。

图4 聚类分析图Fig.4 Dendrogram of cluster analysis

由图4可知，发酵第8天与第16天的风味物质差别不大，发酵第24天与发酵第32天的辣椒较其他时间风味物质差别较大；聚类分析也说明发酵第8天与发酵第16天的辣椒可聚为一类。因此推测发酵第24天与第32天可能是风味物质形成的主要阶段。而辣椒不同发酵时间主成分得分越高，说明此阶段样品所包含的风味物质越接近样品整个发酵过程中主要的香味物质，风味更佳协调[24]。综合评价可得发酵第24天的风味协调性最佳，发酵第32天次之。

3 结 论

利用酸碱滴定法与分光光度法测定不同发酵时间的高盐辣椒的总酸与亚硝酸盐含量，结果表明高盐发酵辣椒总酸含量变化不大，发酵第6天达到最大值。亚硝酸盐含量起初以线性增长，在发酵第24天达到最大，而后减小，发酵全过程未超过国标限量。

利用固相微萃取法和气相色谱-质谱联用技术测定不同发酵时间的高盐辣椒中的挥发性成分，结果表明，发酵第8天的辣椒中酯类、醇类、酸类含量有较大的增加，醛类、芳香族类、酮类物质含量大幅减少。其后，酸类物质在发酵第16天迅速减少。醇类含量在发酵第16天达到最大，其他物质变化不大。但因为挥发性成分不仅与相对含量有关，也与香气活力值具有密切的联系，所以判定某种成分对香气的贡献度还应该进行进一步研究。

利用主成分分析法与聚类分析法分析不同发酵时间的辣椒中的挥发性成分，共分析出22种主要的挥发性风味物质，发酵第8天与第16天的风味物质变化不大，发酵第24天与发酵第32天的辣椒中的风味物质较其他阶段的风味物质差别较大，综合评价可得发酵第24天的风味最为协调。

[1] 周晓媛, 邓靖, 李福枝. 发酵辣椒挥发性成分分析及复合香味剂调配[J]. 中国食品学报, 2007, 7(3): 138-143.

[2] ADAMS M J, AHUJA K D K, GERAGHTY D P. Effect of capsaicin and dihydrocapsaicin on in vitro blood coagulation and platelet aggregation[J]. Thrombosis Research, 2009, 124(6): 721-723.

[3] PETROCELLIS L D, MARZO V D. Lipids as regulators of the activity of transient receptor potential type V1 (TRPV1) channels[J]. Life Sciences, 2005, 77(14): 1651-1666.

[4] KMI M R, LEE K N, YON J M, et al. Capsaicin prevents ethanolinduced teratogenicity in cultured mouse whole embryos[J]. Reproductive Toxicology, 2008, 26(3/4): 292-297.

[5] KAWADA T, HAGIHARA K, IWAI K. Effects of capsaicin on lipid metabolism in rats fed a high fat diet[J]. Journal of Nutrition, 1986, 116(7): 1272-1278.

[6] 蒋立文, 李宗军, 谭周进, 等. 剁辣椒的生产现状及技术进展[J]. 中国酿造, 2006, 25(2): 6-8.

[7] 邓放明, 李罗明, 刘素纯, 等. 碎鲜辣椒发酵制品系列产品生产技术[J].食品与机械, 2004, 20(2): 51-52.

[8] 卫生部食品卫生监督检验所. GB/T 12456—2008 食品中总酸的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[9] 卫生部食品卫生监督检验所. GB/T 5009.33—2010 食品中亚硝酸盐的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2010.

[10] 欧阳晶, 苏悟, 陶湘林, 等. 辣椒发酵过程中挥发性成分变化研究[J].食品与机械, 2012, 28(6): 55-58.

[11] 韩江雪, 丁筑红, 李仲军, 等. 不同乳酸菌强化接种发酵辣椒挥发性风味成分分析[J]. 食品科学, 2012, 33(10): 179-183.

[12] 何绪晓. 发酵辣椒酱工艺及保藏技术研究[D]. 贵阳: 贵州大学, 2008: 8-9.

[13] 钟敏, 宁正祥. 辣椒自然乳酸发酵中的变化及影响发酵质量的几个因素[J]. 广州食品工业科技, 2000, 16(3): 1-3.

[14] 蒋和体. 四川泡菜袋装发酵研究[J]. 食品科学, 1994, 15(4): 39-41.

[15] 卫生部. GB 2762—2005 食品中污染物限量[S]. 北京: 中国标准出版社, 2005.

[16] 贾洪锋. 发酵辣椒中风味物质的研究[D]. 重庆: 西南大学, 2007: 32-33.

[17] 李红, 屠大伟, 李根容, 等. 固相微萃取及主成分分析用于潲水油GC-MS指纹图谱的分析[J]. 计量学报, 2010, 31(5): 101-105.

[18] 范琳. 曲霉型豆豉后发酵过程中挥发性成分的动态变化[J]. 食品科学, 2012, 33(22): 274-277.

[19] 明红梅, 董瑞丽, 许德富. 主成分分析法在大曲质量评价体系中的应用[J]. 中国酿造, 2010, 29(8): 120-123.

[20] 张春雨, 李亚东, 陈学森, 等. 高丛越橘果实香气成分的GC/MS分析[J].园艺学报, 2009, 36(2): 187-194.

[21] 刘晓辉. 四种香料植物挥发油的提取及应用研究[D]. 长春: 吉林农业大学, 2008: 33-34.

[22] 黄建林, 张展霞. 番石榴叶挥发性成分分析[J]. 化学与生物工程, 2006, 23(5): 58-59.

[23] 刘树文. 合成香料技术手册[M]. 2版. 北京: 中国轻工业出版社, 2009: 723-724.

[24] 宋江峰. 甜糯玉米软罐头主要挥发性物质主成分分析和聚类分析[J].中国农业科学, 2010, 43(10): 2122-2131.

Analysis of Changes in the Main Components and Volatile Components in Fermented Chili with High Salt Content

OUYANG Jing1,2, TAO Xiang-lin1,2, LI Zi-ming1,2, LI Yun-qian1,2, JIANG Li-wen2,3,*
(1. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Changsha 410128, China; 3. Fermented Food Engineering and Technology Research Center of Hunan Province, Changsha 410128, China)

The contents of total acids and total nitrites at different fermented stages were determined in the fermented chili with high salt content. Solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS) were used to determine the volatile substances of fermented chili at different stages. The analysis of volatile substances was achieved by the principal components analysis (PCA) and cluster analysis (CA). The results indicated that there was no obvious change in acidity. The content of total nitrites did not exceed the national standard during fermentation. The compounds identified could be classified into 7 groups, including olefins (4), aromatics (9), alcohols (13), aldehydes (7), ketones (3), acids (2) and esters (18). During the initial stage of fermentation, the flavor compounds alcohols, acid and esters were increased. As the fermentation proceeded, the contents of alcohols and esters were increased while the content of acids was reduced. The contents of components from all the groups became more balanced at the end of fermentation. PCA analysis identified 22 main volatile components and the best flavor was achieved on the 24thd of fermentation.

fermented chili with high salt content; volatile components; solid phase micro-extraction-gas chromatographymass spectrometry; principal components analysis; cluster analysis

TS255.54

A

1002-6630（2014）04-0174-05

10.7506/spkx1002-6630-201404036

2013-04-15

湖南省科技厅项目（2012NK3092）；湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目（SCX1220）

欧阳晶（1989—），男，硕士研究生，研究方向为粮食油脂与植物蛋白工程。E-mail：340361409@qq.com

*通信作者：蒋立文（1968—），男，教授，博士，研究方向为粮食油脂与植物蛋白工程。E-mail：1024305380@qq.com