高压结合酶法消减南美白对虾虾仁致敏性

张 悦，胡志和*，谢丹丹，吴子健，薛 璐，李 洋

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）

高压结合酶法消减南美白对虾虾仁致敏性

张 悦，胡志和*，谢丹丹，吴子健，薛 璐，李 洋

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）

以南美白对虾虾仁为原料，研究高压结合酶法对虾仁过敏原致敏性的消减作用。将南美白对虾去头去尾去壳去肠线后，采用超高压法和高压结合酶法消减其致敏性，用间接酶联免疫吸附法检测致敏性消减效果，确定消减条件。结果表明：采用超高压法处理，在压力100 MPa、温度25 ℃、保压时间15 min的条件下，虾仁过敏原的致敏性降低了67.09%，且与处理过程中蛋白溶出量有关；采用高压结合酶法处理，在盐水质量浓度1 g/100 mL、酶与虾仁质量比1∶130、压力450 MPa、温度40 ℃、保压时间55 min的条件下，虾仁过敏原的致敏性降低了86.58%。由此可见，高压处理对虾仁过敏原的致敏性有消减作用，高压结合酶法的消减效果更好。

南美白对虾；高压法结合酶法；木瓜蛋白酶；过敏原消减

食品安全问题受到越来越多人的重视，全球有30%～40%的人患有各种过敏性疾病，并且每年的发病率和死亡率都呈上升趋势[1]。据统计，美国大约有6%的幼儿和3.7%的成年人对某些食品过敏[2-3]，其中海产品就是引起过敏的食品中的一种[4-5]。有报道指出，学龄儿童的食物过敏现象呈上升趋势，与1997年相比，2007年美国学龄儿童食物过敏人数增加了18%[6-7]。近年来也出现了许多关于食用海产品致敏的报道[8-12]。在海产品过敏原消减研究方面，国内外采用的研究方法包括物理法（加热[13]、辐照[14]、微波[15]、超高压[16-17]）、化学法[18]和生物法[19-22]等。在上述研究中，所采用原料主要针对分离纯化后过敏原蛋白进行消减，其研究过程排除了原料中其他成分对过敏原消减效果的影响。对采用整体原料，在不破坏原有形状或组织状态下消减其致敏性的研究鲜有报道。

本研究以南美白对虾虾仁为研究对象，采用超高压法和高压结合酶法对整体虾仁进行处理，消减过敏原蛋白的致敏性。采用间接酶联免疫吸附法（enzyme linked immune sorbent assay，ELISA）对处理后虾仁致敏性的消减程度进行评价，比较其消减效果，为生产低致敏性虾仁提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜活的南美白对虾 市售；海虾过敏人血清天津商业大学校医院，过敏血清池由12人血清（7男，5女；年龄分布：20～23岁7人，52岁1人，35～40岁4人），血清置于－80 ℃冰箱冻存。

木瓜蛋白酶（0.5～2 U/mg）、辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记的羊抗人血清免疫球蛋白E（IgE）抗体A9667 美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HPP.L3型超高压设备 天津市华泰森淼生物工程技术有限公司；DK-42型电热恒温水浴槽 上海精宏实验设备有限公司；3-18K型离心机 美国Sigma公司；Scientz-50N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；FA1104N型电子天平 上海精密科技仪器有限公司；RT-6000型酶标分析仪 深圳雷杜生命科学股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 过敏原蛋白的提取

将处理过的南美白对虾虾仁放在匀浆机中匀浆，每克组织用1 mL的生理盐水悬浮，悬浮液置于冰上5 min后加入4倍体积冷丙酮（－20 ℃预冷过夜），混匀。4 ℃、10 000 r/min离心15 min，将沉淀物移至干净滤纸上，分散并自然风干，即为丙酮粉。丙酮粉与1 mol/L KCl抽提液（含0.5 mmol/L二硫苏糖醇）按料液比1∶10（g/mL）抽提过夜，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，取上清液，沉淀物与抽提液按1∶10抽提4 h，离心取上清液，将两次的上清液合并后透析过夜，再冷冻干燥[23-24]。

1.3.2 超高压处理对虾仁过敏原消减效果

将南美白对虾去头去尾去壳去肠线后，再将虾仁表面的薄膜去掉，每10 g虾加0.85 g/100 mL的盐水（pH 6.5）40 mL，装袋后真空密封，然后进行高压处理。

1.3.2.1 单因素试验

按照方法1.3.1节提取处理后的虾仁中的蛋白，设定保压时间30 min、压力300 MPa、温度30 ℃，通过ELISA检测致敏性，固定其他条件，分别探讨压力（100、200、300、500 MPa）、温度（20、30、40、50 ℃）以及保压时间（10、20、30、50 min）对过敏原的消减效果的影响。

将处理后的盐溶液取出，透析，冷冻干燥，将干燥后的物质（即虾仁中溶出的蛋白）分成两部分，一部分直接进行ELISA检测，确定高压法对溶出的过敏蛋白的消减效果；另一部分检测蛋白含量（凯氏定氮法），确定蛋白溶出的量。

1.3.2.2 条件优化

根据单因素试验结果，以压力大小、温度以及保压时间为影响因素，进行L9（33）正交试验。处理后的虾仁提取蛋白，检测过敏原消减效果。

1.3.3 高压结合酶法对虾仁中过敏原消减效果

1.3.3.1 单因素试验

将南美白对虾去头去尾去壳去肠线后，再将虾仁表面的薄膜去掉，按每10 g虾加0.85 g/100 mL的盐水（pH6.5）40 mL，按照酶与虾仁质量比为1∶200加入木瓜蛋白酶[17]，装袋、真空密封后进行高压处理。

单因素试验操作同1.3.2.1节。

1.3.3.2 条件优化

根据单因素试验结果，以压力大小、温度以及保压时间为影响因素，以492 nm波长处的光密度（optical density，OD）值为考察目标（每组做6个平行，取均值），按照L9（34）设计正交试验。处理后的虾仁提取蛋白，检测过敏原消减效果。

1.3.4 盐水质量浓度对虾仁过敏原致敏性消减效果影响

改变处理虾仁的盐水的质量浓度（0.85、1.0、1.25、1.5 g/100 mL），利用高压结合酶法的优化的条件对虾仁进行处理。处理后的虾仁，检测致敏性消减效果。

1.3.5 间接酶联免疫检测方法[25]

包被抗原时每个样品做6个平行孔，在酶标板上每孔加100 μL（10 mg/mL）待测物，置于4 ℃包被过夜。用洗液洗5次，每次3 min，拍干。每孔加封闭液200 μL磷酸盐吐温缓冲液含1 g牛血清白蛋白，37 ℃水浴3 h，洗涤后拍干，每孔加入100 μL一抗（用封闭液稀释20倍的过敏人血清），37 ℃水浴2 h，洗涤后拍干，加入用HRP标记的羊抗人IgE，37 ℃水浴2 h。洗涤拍干，每孔加邻苯二胺100 μL，37 ℃显色15 min，每孔加50 μL终止液（2 mol/L H2SO4），最后在492 nm波长处测定OD值。

致敏性消减率/%=（阳性对照OD492nm－消减样品OD492nm）/阳性对照OD492nm×100

式中：阳性对照为未处理虾仁过敏原蛋白与过敏者血清反应的OD492nm值；消减样品OD492nm值为处理后的样品过敏原蛋白与过敏者血清反应的OD492nm值。

2 结果与分析

2.1 高压对虾仁中过敏原消减效果

2.1.1 高压对虾仁中过敏原消减单因素试验

表1 不同条件下高压处理虾仁的致敏性变化（x±s=4）Table 1 Changes in allergenicity of shelled fresh shrimp after high static pressure treatment under different conditions (x±s, = 4)

由表1可知，在上述条件下，处理后的虾仁蛋白与抗体反应的OD492nm值较阳性对照的OD492nm值都有所降低。当作用温度和保压时间一定（30 ℃，30 min），随着压力的增大（100～500 MPa），致敏性消减逐渐降低；压力和保压时间一定（300 MPa，30 min）时，随着温度的升高（20～50 ℃），致敏性消减逐渐降低；压力和温度（300 MPa，30 ℃）一定，保压时间不同（10～50 min），在20～30 min范围内较好。另外，从表1可以看出，其致敏性消减效果与各种条件下蛋白溶出量有关，溶出量多，致敏性消减效果好。从溶出蛋白与抗体反应的OD值来看，与处理后虾仁蛋白致敏消减无明显相关性。因此，在上述条件下，虾仁致敏性消减与高压作用过程蛋白的溶出有关。

对于溶出蛋白，在3 0 0 M P a条件下高温（40～50 ℃）或长时间（50 min）处理，有利于其致敏性的消减，其消减效果与蛋白溶出量无关。

2.1.2 高压法对虾仁中过敏原消减条件优化

由表2可知，通过高压处理后的虾仁，其蛋白经ELISA检测，得出3种因素对OD492nm值的影响大小依次为A＞B＞C，即压力＞温度＞保压时间，较好的试验方案为A1B2C1，即压力100 MPa、温度25 ℃、保压时间15 min，经过验证，此条件下处理产物与抗体反应的OD492nm值为0.192 5，致敏性消减67.09%。该值虽不在正常人血清与抗体反应的OD492nm值范围（0.03～0.05）内，但与未处理的虾仁蛋白的阳性对照相比（血清反应OD492nm值0.585 0±0.014 2），已经有很大程度的降低，说明超高压技术对虾仁中过敏原的消减起到了一定的作用。另外，在所选择的条件范围内，其虾仁在各条件下致敏性的消减与其蛋白的溶出量高度一致，因此，在300 MPa以下处理虾仁，其致敏性消减与各条件下虾蛋白溶出相关。

表2 高压消减虾仁中过敏原条件优化 (x±s,= 4）Table 2 Optimization of high static pressure treatment conditions for shelled fresh shrimp (x±s, = 4）

从溶出蛋白的致敏性消减效果来看，较好的处理条件为压力为200 MPa、温度30 ℃、保压时间20 min，其消减效果与溶出蛋白的量无关。

根据表2的结果，单一采用高压法处理虾仁，过高的压力并不能很好地消减过敏原，其原因比较复杂。1）作为整体虾仁，在高压作用下，会引起蛋白质二级以上结构的变化[26-27]，导致过敏原的空间表位会发生变化，从而使其致敏性的降低或升高；2）在高压处理过程中，虾仁中的可溶性蛋白（包括过敏原蛋白）会向盐溶液中渗透[28]，渗透的多少，也会影响虾仁的致敏性；3）高压处理会导致蛋白质的变性，从而发生溶解性能的变化，影响蛋白质向盐溶液渗透；4）高压下过敏原蛋白会与虾仁组织的其他成分作用，也会影响致敏性的变化。从消减效果看，对于虾仁，其溶出蛋白的量对消减效果致敏性消减影响较大；对溶出蛋白，适当的处理条件对致敏性消减影响较大，但与溶出量无关。

采用高压处理虾仁，其本质是物理作用，只能改变蛋白的二级以上结构，而不能改变其一级结构。因此，单独高压处理虾仁或蛋白，只能作用其空间表位，而不能改变其线性表位。要进一步提高虾仁致敏性的消减效果，可采用高压结合酶的处理方式，在消减空间表位的同时，通过选择合适的蛋白酶，水解过敏原蛋白，进一步消减线性表位。

2.2 高压结合酶法对虾仁中过敏原消减效果的影响

2.2.1 高压结合酶法在不同条件下对虾仁中过敏原消减作用

表3 不同条件下高压结合酶法处理虾仁的致敏性变化 (x±s, = 4）Table 3 Change in allergenicity of shelled fresh shrimp after high static pressure in combination with enzyme treatment under different conditions (x±s, = 4）

根据方法1.3.3.1节进行试验，结果见表3。在作用温度和时间（30 ℃、30 min）一定时，500 MPa处理虾仁，其致敏性消减75.16% ；当压力和作用时间（300 MPa，30 min）一定时，50 ℃处理虾仁，蛋白致敏性消减74.87%；当压力和温度（300 MPa，30 ℃）一定时，处理50 min，虾仁蛋白致敏性降低70.60%。由上述结果可以看出，在酶的参与下，在所选择的条件范围内，高压、高温、长时间处理虾仁，有利于虾仁蛋白致敏性的消减。

与表1中的结果相比，虾仁及溶出蛋白的致敏性均有显著降低。但虾仁致敏性消减效果，与蛋白溶出量无关。另外，由于蛋白酶的加入，影响了高压处理条件下蛋白质的溶出，其原因可能是蛋白酶的加入改变了盐溶液中溶质的浓度。

从表3中虾仁致敏性消减效果可以推测，虾仁内部过敏原蛋白的消减，可能是由于蛋白酶作用的结果，即蛋白酶可渗透虾仁内部发挥作用。从溶出蛋白的消减效果可以看出，在300 MPa、40 ℃、30 min的处理条件，其血清反应的OD492nm值接近正常人血清反应值范围（0.03～0.05），溶出的蛋白消减了90.9%，这说明在该条件下，其酶活影响较小[16]。

2.2.2 高压结合酶法消减虾仁中过敏原的条件优化

根据方法1.3.3.2节所设计的条件进行正交试验，其结果见表4。

表4 高压结合酶法消减虾仁过敏原条件优化 (x±s,= 4）Table 4 Optimization of conditions for reducing the allergenicity of shelled fresh shrimp by high static pressure in combination with enzyme treatment (x±s, = 4）

由表4可知，通过高压结合酶法处理后的虾仁，4种因素的影响大小依次为A＞B＞C＞D，即压力＞温度＞保压时间＞酶与虾仁质量比，较好的试验方案为A2B2C1D1，即压力为450 MPa、温度40 ℃、保压时间55 min、酶与虾仁质量比1∶130，经过验证实验，此条件下的产物与抗体反应的OD492nm值为0.084，致敏性消减85.64%。出现上述结果可能有以下几方面的原因：1）超高压能够破坏虾仁中蛋白质的空间结构[26-27]，使过敏原的空间表位被掩盖或者破坏；2）高压能够使虾仁中的过敏原蛋白变性，有利于酶的作用；另外，虾仁中蛋白质的溶出更有利于酶的作用（表3）；3）高压也能够使酶渗入虾仁内部，从而水解虾仁内部的过敏原蛋白；4）高压能够影响酶的活性，但在所选择的的条件范围内，酶活损失较小[16]。

2.2.3 盐水质量浓度对虾仁中过敏原致敏性消减效果的影响

将虾仁（10g）分别加入0.85、1.0、1.25、1.5 g/100 mL的盐水（40 mL、pH 6.5），按照酶与虾仁的质量比1∶130加入木瓜蛋白酶，装袋、真空密封后，再利用高压结合酶法对虾仁进行处理（条件为压力450 MPa、温度40 ℃、保压时间55 min），结果见表5。

表5 盐水质量浓度对虾仁中过敏原消减效果的影响 (x±s, = 4）Table 5 Effect of salt solution concentration on reducing the allergenicity of shelled fresh shrimp (x±s, = 4）

由表5可知，盐水的质量浓度对虾仁中过敏原的消减效果有一定的影响，与0.85 g/100 mL的盐水质量浓度相比，1.0 g/100 mL更有助于虾仁致敏性的消减，其致敏性消减86.58%。因此，按照虾仁与盐水（质量浓度1 g/100 mL，pH 6.5）质量比1∶4，酶与虾仁的质量比为1∶130加入木瓜蛋白酶，装袋，真空密封；在压力450 MPa、温度40 ℃、保压时间55 min的条件进行处理，可获较好的消减效果。

3 结 论

利用超高压法和高压结合酶法处理虾仁对其致敏性具有较好的消减作用。单一采用超高压处理，虾仁致敏性消减效果与处理过程中虾仁蛋白二级以上结构变化及蛋白溶出量有关，其作用只会影响过敏原空间表位；采用高压结合酶法处理效果好于单独采用高压处理法，但影响因素要比较复杂，适当调整各种因素（压力、温度、时间、酶与虾仁质量比、盐水质量浓度、虾仁与盐溶液比例），都会影响虾仁蛋白致敏性的消减作用，其作用不仅影响过敏原蛋白的空间表位，同时会破坏其线性表位，致敏性消减效果更好。

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Reducing Allergenicity of Penaeus vannamei Shelled Fresh Shrimp by High Static Pressure in Combination with Enzyme Treatment

ZHANG Yue, HU Zhi-he*, XIE Dan-dan, WU Zi-jian, XUE Lu, LI Yang
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

This study examined the effects of high static pressure in combination with enzymatic digestion on reducing the allergenicity of fresh shrimp (Penaeus vannamei). The fresh shrimp was treated by high static pressure in combination with enzymatic digestion after the head, tail, shell, and catgut were removed. Indirect enzyme-link immunosorbent assay was used to e valuate its allergenicity-reducing effect under established experimental conditions. Results showed that when shelled fresh shrimp was treated at 100 MPa for 15 min at 25 ℃, the allergenicity was reduced by 67.09%, and this effect was related to the quantity of dissolved protein. When shelled fresh shrimp was soaked in 1 g/100 mL salt solution, digested with papain at a ratio 1:130 of papain to shrimp, vacuumed, and then treated at 450 MPa for 55 min at 40 ℃, the allergenicity was reduced by 86.58%. These results showed that the allergenicity of shelled fresh shrimp could be reduced by high static pressure treatment, and a superior effect was achieved by combination with enzyme digestion.

Penaeus vannamei; highstatic pressure in combination with enzyme treatment; papain; reducing allergenicity

TS201.6

A

1002-6630（2014）04-0006-05

10.7506/spkx1002-6630-201404002

2013-07-16

国家自然科学基金面上项目（31271841）

张悦（1988—），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：moyouyouyy@126.com

*通信作者：胡志和（1962—），男，教授，硕士，研究方向为专用功能食品。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn