RP-HPLC内标标准曲线法测定茶油中的7种酚类物质

王进英 钟海雁

(中南林业科技大学食品科学与工程学院1，长沙 410004)(粮油深加工与品质控制湖南省重点实验室2，长沙 410004)

茶油是我国特有的传统木本食用植物油之一，茶油中含有的酚类物质具有具有良好的自由基清除作用[1]，其抗氧化效果明显优于生育酚[2]，从而能有效的抑制油脂的氧化保证茶油具有良好的储藏稳定性[3-4]。

目前各种植物中酚类物质含量测定方法要分为总酚含量的测定[5-7]和各酚类组分单体分析[8]，这2种分析方法也应用于茶油中酚类物质的分析。丁明等[9]采用Folin-Ciocaltea 法测定了茶油中的总酚。罗凡等[10]建立了同时分离、检测茶油中23 种酚类物质的高效液相色谱外标标准曲线法。国外，在橄榄油的研究中采用以丁香酸为内标物的内标法对橄榄油中的酚类物质进行定性和定量分析[11]。内标法标准曲线结合了峰面积归一法和外标法，它是在加入内标物后，按峰面积归一法进行定量，避免了由于进样的一致性及样品歧视效应导致的误差，它的分析精密度也较高，是液相色谱的一种比较理想的定性和定量分析方法[12]。本试验建立了油茶籽油中天然酚类物质含量的高效液相色谱内标标准曲线分析方法，分析测定茶油中的多酚，特别是简单多酚，为进一步研究油茶籽油中酚类物质奠定了一定的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

茶油样品如表1所示。

表1 茶油样品信息表

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

1200型高效液相色谱仪：ZORBAX SB-C18分析型色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美国Agilent公司；UV-1800紫外可见分光光度仪：日本岛津公司；Diol 二醇基-SPE(6 mL，500 mg)固相萃取小柱：美国Supelco公司；SEP5010型固相萃取真空装置：日本岛津公司；MD200-1氮气吹扫仪：杭州奥盛仪器有限公司；AL204型电子天平：Mettler Toledo仪器(上海)有限公司；FE20型pH计： Mettler Toledo仪器(上海)有限公司；B5510E-DTH型台式超声波清洗机：美国Branson公司；DW-86L628型超低温冰箱：海尔公司；英国ELGA分析型超纯水系统：上海恒奇仪器仪表有限公司。

1.2.2 试剂与标准品

没食子酸、3，4-二羟基苯乙酸、儿茶素、4-羟基苯乙酸、丁香酸、邻香草醛、2-羟基肉桂酸、槲皮素对照品：美国Sigma公司。甲醇：色谱纯，美国TEDIA天地试剂公司；乙酸(色谱纯)、乙酸乙酯(分析纯):天津市化学试剂研究所；分析纯正已烷：国药集团化学试剂有限公司；超纯水：英国ELGA分析型超纯水系统制取。

1.3 试验方法

1.3.1 内标标准溶液的制备

准确称取15 mg丁香酸标准品，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得内标标准溶液。

1.3.2 对照品溶液的制备

分别称取没食子酸对照品41.25 mg，3,4-二羟基苯乙酸对照品75 mg，儿茶素对照品81.25 mg，4-羟基苯乙酸116.3 mg，邻香草醛对照品50 mg，2-羟基肉桂酸对照品10 mg，槲皮素对照品68 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。经0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.3.3 供试品溶液的制备

准确称取2. 5 g茶油，溶于6 mL正己烷中，将二醇基固相萃取柱置于真空洗脱设备中，分别连续过6 mL甲醇和6 mL正己烷，释放真空，将油溶液过柱，此时样品留在固相上，分别用3 mL正己烷过柱清洗2次，再用4 mL正己烷- 乙酸乙酯( 90∶10) 过柱，最后用10 mL甲醇洗柱，加入1 mL丁香酸内标标准溶液，氮吹仪吹干，残渣溶于1 mL甲醇-水(1∶1) 中，过0. 45 μm滤膜，待测。

1.4 色谱条件

色谱柱：ORBAX SB-C18分析型色谱柱(4.6 mm×250 mm；5 μm)；柱温： 25 ℃；检测波长：280 nm；流动相：A(甲醇)，B(0.2%乙酸)；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

2 结果与讨论

2.1 试验条件的优化

2.1.1 流动相的选择

由于酚类化合物常带有酚羟基，在水中会部分解离。而未解离的羟基与固定相作用较强，导致拖尾。所以仅用甲醇水作流动相很难实现标样的完全分离[13]。梯度洗脱中在水相中加入一定的酸分离效果和峰型明显改善[14]。罗凡等[10]分别以1% 甲酸、0.1%甲酸、0.2%乙酸与甲醇作为流动相采用相同的梯度洗脱条件进行分离，结果表明 0.2%乙酸与甲醇为最适流动相。本试验中以甲醇(A)和含0.2%乙酸的水(B)作为流动相，对油样1选取3个洗脱程序对油样进行洗脱，色谱图如图1 所示。

图1 3种梯度洗脱分离油样的液相色谱图(280 nm)

由图1可以看出，在3个洗脱梯度中，梯度3的分离效果最好，尤其是在25～35 min之间，使各物质达到了良好分离，而且基线漂移现象得到了一定改善，梯度3的洗脱程序如表2所示。

2.1.2 检测波长的选择

通过紫外分光光度计对8种酚类的标样溶液在200～400 nm内进行全波长扫描，得到各物质的8种酚类物质的紫外吸收光谱图，如图2所示。从图2可以看出，在215 nm和280 nm都有较强的吸收，研究表明215 nm处基线噪声较大，检测效果不好[15]。经试结合各种酚类物质研究文献[16-20]中对检测波长的选择，在吸收波长为280 nm时，各标准品都具有较大吸收，分离效果、峰型最好，且各种酚都得到了完全分离。考察样品在本HPLC条件下的实际吸收情况，选定280 nm为检测波长。

图2 各种酚类化合物的紫外吸收光谱图

2.1.3 内标物质的选择

内标法的关键是选择合适的内标物，内标物应该是原样品中不存在的纯物质，它的性质应尽可能与被测组分相近，不与被测样品起化学反应，同时要能完全溶于被测样品中。内标物的峰应尽可能接近被测组分的峰，或位于几个被测组分的峰中间，但必须与样品中的所有峰不重叠[21]。本试验参照国外橄榄油研究[22-24]，选定丁香酸为内标物质。

2.2 内标标准曲线与线性范围

2.2.1 相对校正因子的测定

取1.3.2中对照品溶液注入高效液相色谱仪，平行测定6次，相对校正因子按式：f=(As×mi) /(Ai×ms) 计算，式中：As为内标物质的峰面积；Ai为对照品的峰面积；ms为内标物质溶液的质量；mi为对照品溶液的质量。测定结果如表3所示，其相对标准偏差在3.2%以内。

表3 8种组分的绝对校正因子及相对校正因子(n=6)

2.2.2 线性试验

取“1.3.2”对照品溶液0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置于10 mL容量瓶中，各加1 mL丁香酸内标标准溶液，加甲醇定容值刻度，制成具有浓度梯度的一系列溶液，在优化色谱条件下依次进样分析。以各种酚类物质的峰面积与丁香酸峰面积的比值作为纵坐标(Ai/As)，以各种酚类物质的含量与丁香酸含量比值为横坐标(mi/ms)，绘制标准曲线，进行回归计算，得回归方程。假设高效液相色谱仪最低相应值S=3N(N为仪器噪音水平)，以S/N=3时，所对应标准溶液中所含组分的含量为检出限，结果见表4。7种酚类物质在各自的线性范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.998，检出限为0.008～0.028 μg /g，能满足定量分析的要求。

表4 7种组分的线性回归方程、相关系数、线性范围及检出限

2.3 方法学考察

2.3.1 稳定性

按照“1.3.3”制备油样3的供试样品1份，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样分析，记录色谱图。试验结果表明，样品在室温条件下在0～24 h内稳定，各色谱峰的相对标准偏差在2%左右。

2.3.2 精密度

取“1.3.2”中所列对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，连续测定6次，测得各组分的保留时间和峰面积的RSD，以考察方法的精密度。如表5所示， 8种物质的保留时间和峰面积的RSD分别小于1.8%和3.9%，表明本法精密度较好。

表5 8种酚类物质的保留时间和峰面积精密度试验(n=6)

2.3.3 重复性试验

以8号油样为样品，按照“1.3.3”制备供试样品6份，在优化色谱条件下进样分析，测得7种组分的平均含量，如表6所示，RSD 小于3%。

表6 1号油样中7种酚类物质的含量(n=6)

2.3.4 回收率

取8号油样3份，分别加入一定浓度的混合标准溶液，按“1.3.3”样品溶液制备方法项下制备，测定含量，计算回收率和RSD，结果见表7。从表7可以看出，各组平均回收率为在76.783%～88.956%之间，RSD在3%左右(n=3)，表明样品在前处理过程中有一定的损失，在样品处理过程中应进一步优化提取条件。

表7 茶油中7种酚类物质的加标回收率和相对标准偏差(n=3)

2.4 实际样品测定

取1～7号油样各2.5 g，按照“1.3.3”制备供试样品3份，在已确定的色谱条件下进样分析，测得每种物质的峰面积，根据每种物质的线性回归方程计算出各酚类物质的含量。结果表明，在选定的7种酚类物质中，茶油中只含有其中的4种，分别为没食子酸、儿茶素、4-羟基苯乙酸、槲皮素，7个油样中4种酚类物质的含量如表8 所示。选定7种多酚作为标准样品主要是根据前人的研究结果进行的[10]。但本次供试的样品中仅检测到其中的4种，其主要的原因可能是其余3种多酚含量较低，因此，前处理方法，如油样提取物中多酚的富集，仍是值得研究的问题，这样有利于较全面地认识茶油的多酚组成。

表8 茶油中4种组分含量/μg/g(n=3)

3 结论

选用丁香酸为内标物，对样品前处理和色谱分析条件都进行优化选择后，建立了反相高效液相色谱内标标准曲线法同时测定茶油中7种酚类物质的方法。试验结果表明，在选定的7中酚类物质中茶油只含有其中的4种，分别是没食子酸、儿茶素、4-羟基苯乙酸、槲皮素，而且这4种物质在8个油样中的含量各异，这可能与茶油的加工方法和品种有关。该方法准确，适用性好，可用于茶油中酚类物质的定性与定量分析。

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