喷射蒸煮结合超滤技术制备大豆分离蛋白及其表征

朱乐平 杨 娟 高志明 杨晓泉 胡 磊 杨薇薇

(华南理工大学轻工与食品学院 食物蛋白工程研究中心，广州 510640)(黑龙江摇篮乳业股份有限公司，哈尔滨 150000)

大豆浓缩蛋白(Soy protein concentrate, 简称SPC)是采用低变性豆粕除去水溶性或醇溶性非蛋白成分后，所制得的大豆蛋白产品。功能性大豆浓缩蛋白是以大豆浓缩蛋白为原料，通过蛋白质改性制取，可以提高净蛋白质含量，改善整体蛋白质氨基酸的可消化利用性，清除可溶性糖分从而减少多种抗营养因子的危害，降低美拉德反应在大豆加热过程中对赖氨酸利用效率的影响，价格实惠，容易获得。但大豆浓缩蛋白经醇提工艺后普遍存在溶解性较低，影响大豆蛋白品质和营养性的物质去除不彻底等问题。大豆异黄酮是多酚类植物雌激素，具有预防癌症、保护心血管和防止骨质疏松等多种生理活性，但是对儿童尤其是婴儿的食用安全性尚存有争议。

喷射蒸煮技术(Hydrothermal cooking或 Jet cooking)，是一种利用高温高剪切力处理样品的加热技术，已经被有效的利用到蛋白的提取和结构重组中。Xia等[1]利用喷射蒸煮技术实现了制备高品质的碎米和米糠蛋白，并通过蛋白表面疏水性的测定发现随着温度的升高，有更多具有较低结合力的疏水作用位点暴露在蛋白分子表面。国外已经有利用喷射蒸煮技术提高蛋白质提取效率和改善蛋白质功能特性的研究[2-3]。

超滤技术是在压力驱动下筛分小分子物质的过程，其中以切割分子质量的大小作为标准，对料液进行进一步的分离以及浓缩，可以达到去除一定小分子物质的作用。Kumar等[4]已经研究了超滤技术对大豆蛋白浓缩等方面的应用。

为进一步解决大豆蛋白配料在应用中的安全性及营养性的问题[5-6]，克服现有加工技术的局限，改善现有大豆蛋白配料中植物雌激素异黄酮偏高及商业功能性大豆浓缩蛋白溶解性差、色泽差、功能性受限和感官特性差等方面的不足，本试验对商业功能性大豆浓缩蛋白进行喷射蒸煮结合超滤处理制备蛋白的研究，并对蛋白的相关特性进行了研究，以期在豆基婴儿配方奶粉、青少年饮料等产品中得以开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

喷射蒸煮发生器：广州南联食品机械公司；CR-300 型色彩色差计：日本Minolta公司；液相色谱仪，1525型泵，4687检测器：Waters公司；Rapid N cube-杜马斯定氮仪：法国Elementar公司；2501PC-紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；Nano-ZS&MPT-2-Zeta电位及纳米粒度分布仪：英国Malvern公司；CR22G-型冷冻离心机：日本HITACHI公司；JM-S052W中空超滤膜：广州洁圣膜技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋白的制备

喷射蒸煮结合超滤技术制备分离蛋白。制备参考Wang等[7]的方法，超滤膜选取截留分子质量为80 ku。大豆浓缩蛋白按1∶10的比例加蒸馏水，用2 mol/L的NaOH调pH 至9.0，于常温下搅拌2 h，得蛋白乳浆。将蛋白乳浆进行胶体磨处理，然后置于喷射蒸煮器中120 ℃处理90 s，采用超滤膜过滤后用2 mol/L 的HCl调pH至4.5，酸沉30 min后，25 ℃、3 000 ×g下离心15 min，蛋白沉淀重新溶于7倍体积去离子水中，取可溶组分调节pH至7.5，经透析、冷冻干燥得蛋白样品SPC-HTC-UF。

喷射蒸煮制备分离蛋白。不采用超滤膜过滤，其余操作同SPC-HTC-UF，得对照样品SPC-HTC。

普通的酸沉制备分离蛋白。低温脱脂豆粕，经碱溶酸沉提取制备蛋白，采用郑二丽[8]的方法，得对照样品SPI。

1.2.2 蛋白质含量、氮溶指数和得率的测定

商务英语是一种交流较为灵活的英语应用方式，商务英语更多应用在对外贸易、经济交流方面，所以掌握口语英语能力是必须的，商务英语和普通英语最本质的区别在于商务英语是一种社会化语言形式。商务英语在农产交易中的应用具有以下几个特点：

采用Dumas燃烧法测定样品的含氮量，天冬氨酸作为氮校准标准物。称取100 mg待测样品放入锡箔纸内进行压片，测量待测样品前，采用2个空白样和3个天冬氨酸样校准。空白样测量时氧气流量设定为50 mL/min，其他样品测量时氧气流量设定为150 mL /min。蛋白质含量=含氮量×6.25。

氮溶指数(NSI)：蛋白样品溶于去离子水使其浓度为1%(w/v)，取适量溶液20 ℃、10 000 ×g下离心10 min，采用Lowry法于500 nm 处测吸光值的方法测定氮溶指数。NSI=溶液中可溶性氮含量/溶液中总氮含量×100%。

蛋白质得率=蛋白样品质量/原料(脱脂豆粕或SPC)质量×100%。

1.2.3 色泽的测定

采用色彩色差计测定色泽[9-10]，W表示白度，L*表示明度，a*和b*表示色度。a*正值表示偏红，负值表示偏绿，b*正值表示偏黄，负值表示偏蓝。W=100-[(100-L*)2+a*2+b*2]1/2，白度值越高，表明色泽越浅。

1.2.4 Zeta电位测定

根据Surh等[11]的方法，测定1%(质量分数)的蛋白溶液pH值从2.0至10.0的Zeta 电位。测定比色池规格为1 cm聚苯乙烯池，采用1对0.45 cm2铂电极，间距0.4 cm，测定温度25 ℃，温度平衡时间2 min，重复测量3次计算平均值为测定值。

1.2.5 异黄酮含量的测定

测定方法参考GB/T 23788—2009[12]，略有改动。称取50 mg蛋白样品，用2.5 mL去离子水溶解，加入木瓜蛋白酶2 400 u/g，在50 ℃、pH 6.5条件下搅拌1 h。加入5 mL甲醇，1 mL 0.1 mol/L HCl，搅拌2 h，然后12 000 r/min离心15 min，取上清液过0.22 μm滤膜，上液相测定。

色谱条件：色谱柱C18，4.6 mm×250 mm，粒度5 μm不锈钢色谱柱。流动相A，乙腈；流动相B，磷酸水溶液(pH=3)。流速0.5 mL/min，波长260 nm，进样量10 μL，梯度洗脱条件为A(%)/B(%)在0～10 min为12/88，10～23 min为18/82，23～30 min为24/76，30～55 min为30/70，55～56 min为80/20，56～60 min为12/88。

1.2.6 蛋白体外消化性测定

体外消化试验参考王晓燕[13]的方法，适当修改。1 g蛋白样品溶解于100 mL 0.1 mol/L HCl体系，按照胃蛋白酶与蛋白1∶100的比例37 ℃孵化10 min后加入酶，于集热式恒温加热磁力搅拌器中反应60 min后取样，加入等体积10%(质量分数)三氯乙酸沉淀未消化的蛋白，离心(5 000×g，10 min，20 ℃)后取上清液测定可溶性氮含量。胃蛋白酶消化产物调pH至7.0后加入胰蛋白酶，效价比同胃蛋白酶，恒温反应120 min后同上取样进行测定。

2 结果与讨论

2.1 蛋白质纯度、氮溶指数及得率

经不同处理得到的蛋白纯度、氮溶指数及得率变化如图1所示。

注：SPI，低温脱脂豆粕碱溶酸沉法提取制备的大豆分离蛋白；SPC，商业功能性大豆浓缩蛋白；SPC-HTC，喷射蒸煮制备蛋白；SPC-HTC-UF，喷射蒸煮结合超滤技术制备蛋白。图1 蛋白纯度、氮溶指数和得率

喷射蒸煮结合超滤处理后，SPC的纯度和NSI显著提高，SPC、HTC和SPC-HTC-UF的纯度分别为63.57%、81.62%和84.63%，相比于SPC的NSI(8.77%)，HTC和SPC-HTC-UF的NSI分别增加了17.06%和67.71%，其中超滤对氮溶指数的影响相对不明显。异黄酮等小分子物质的去除是蛋白纯度提高的一重要原因，HTC处理提高了NSI的结果与文献报道的结论一致[3,5]，原因可能是SPC中难溶的蛋白在高温、高压、高剪切力作用下，蛋白分散性增加，粒度减小，从而提高蛋白的溶解性。大豆分离蛋白以其良好的功能性和高蛋白营养性被广泛应用于食品工业中，功能性大豆浓缩蛋白与之相比，明显的缺陷在于蛋白质质量分数低(70%左右)，溶解性低(NSI<10%)，使其一些功能性质比不上大豆分离蛋白[14-15]。从图1可见，喷射蒸煮结合超滤技术制备的分离蛋白SPC-HTC-UF，蛋白纯度和NSI均与SPI接近，这表明喷射蒸煮结合超滤技术可以改善SPC的某些品质，为拓宽其应用提供条件。SPC经喷射蒸煮处理后，超滤处理使得率下降。

2.2 蛋白的色泽

经不同处理得到的蛋白色泽如表1所示。

表1 蛋白的色泽

注：测量值是3次测定的平均值，上标a～c表示显著性差异(P<0.05)。

各样品的白度值有显著性差异。喷射蒸煮制备的分离蛋白SPC-HTC 比SPC的白度值高，喷射蒸煮结合超滤技术制备的分离蛋白SPC-HTC-UF白度值最高，三者均比SPI高。白度值越高，样品的色泽越浅。可能是因为醇洗、水热处理及超滤去掉了大部分具有色泽的物质，还与糖基化程度、所得蛋白的纯度、蛋白原料等密切相关。

2.3 Zeta电位变化

不同pH值条件下蛋白溶液的Zeta 电位变化如图2所示。

图2 zeta电位曲线

Zeta电位的绝对值越大，溶液体系越稳定[16]。Zeta电位是对颗粒之间相互排斥或吸引力的强度的度量，数值(正或负)越高，越倾向于溶解或分散；数值(正或负)越低，越倾向于凝结或凝聚。图2中Zeta电位的变化一定程度反映了蛋白溶液体系的变化。在pH=4时，SPC的Zeta电位为负，经处理的SPC-HTC和SPC-HTC-UF为正，表明作用力从负的静电排斥力转为正的静电排斥力。酸性条件下，SPC的最大Zeta电位值出现在pH 2，SPC-HTC和SPC-HTC-UF的最大Zeta电位值都在pH 3，表明最强静电排斥力出现的pH条件改变。同时，等电点也发生了明显的向右偏移。一方面由于高温处理过程中，蛋白肽链展开，有更多的带电氨基酸富集在蛋白表面，同时一些小分子带电物质被去除，使得Zeta电位发生变化。由图2可看出，在pH 2～5的范围内，喷射蒸煮及超滤技术处理的蛋白zeta电位的绝对值高于SPC。

2.4 异黄酮含量

大豆异黄酮的含量如图3所示。

图3 大豆蛋白的异黄酮含量

本试验监测了在大豆中比较常见和含量较多的6种异黄酮，即大豆糖苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木苷和染料木素，以其总量计为大豆异黄酮的含量。通过标准样品在液相色谱中峰面积与异黄酮含量的标准曲线公式，计算得到SPI中异黄酮含量约为0.72 mg/g，SPC中异黄酮含量约为0.15 mg/g，SPC-HTC中异黄酮含量约为0.10 mg/g，SPC-HTC-UF中异黄酮含量约为0.07 mg/g，经喷射蒸煮和超滤处理异黄酮含量均降低。各蛋白中的异黄酮类型都以苷元型的大豆异黄酮为主，这可能与糖苷型的异黄酮在加热、浸泡、碱溶等过程中更容易损失或者转化有关，苷元型的异黄酮溶解性差，与大豆蛋白具有更好的天然结合能力。尽管大豆中大豆异黄酮的含量不高，一般为128 mg/100 g，但对于雌激素水平较低的婴儿来说，其剂量仍有风险，对于雌激素浓度更低的男婴来说，大豆异黄酮对雌激素敏感系统可能有负面影响[17]。有研究表明，天然存在的大豆蛋白与异黄酮结合牢固，浓缩蛋白难以彻底去除异黄酮。因此，在豆基奶粉的应用上，可考虑使用水解蛋白，并在此基础上再通过相关手段进一步降低异黄酮含量。

2.5 蛋白的消化特性

蛋白消化特性的变化如图4。

图4 蛋白体外消化的氮释放量

经过胃蛋白酶的消化，SPC-HTC和SPC-HTC-UF的氮释放量分别为49.87%和50.23%，远高于SPC(16.38%)，在胰蛋白酶消化的阶段，SPC-HTC和SPC-HTC-UF的氮释放量为69.18%和69.88%，远高于SPC(33.24%)，同SPC相比，SPC-HTC和SPC-HTC-UF表现了更容易被消化利用。

3 结论

本研究以商业功能性大豆浓缩蛋白为原料，采用120 ℃、90 s的喷射蒸煮处理及80 ku的超滤膜制备大豆分离蛋白，并对其进行表征。蛋白纯度、氮溶指数、色泽、稳定性有较大改善，异黄酮的含量大大减少，且经喷射蒸煮及超滤后的蛋白具有较好的消化性。喷射蒸煮处理可以显著提高所制备蛋白的溶解性，80 ku超滤膜可以有效降低大豆异黄酮的含量。

[1]Xia N, Wang J M, Yang X Q, et al. Preparation and characterization of protein from heat-stabilized rice bran using hydrothermal cooking combined with amylase pretreatment [J]. Journal of Food Engineering, 2012, 110, 95-10

[2]Wang H, Wang T，Johnson L A. Effect of alkali on the refunctionalization of soy protein by hydrothermal cooking [J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society,2005, 82(6): 451-456

[3]Wang C Y, Johnson L A. Functional properties of hydrothermally cooked soy protein products [J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 2001, 78(2): 189-195

[4]Kumar N S, Yea M K, Cheryan M. Soy protein concentrates by ultrafiltration [J]. Journal of Food Science, 2003, 68(7):2278-2283

[5]戴显祺,李晓东,李铁红. 豆基婴儿配方奶粉的发展与营养安全性评价[J].中国乳品工业, 2008, 36(4) : 52-54

[6]吴坤. 营养与食品卫生学[M]. 第五版.北京: 人民卫生出版社, 2003:15-78

[7]Wang J M, Xia N, Yang X Q, et al. Adsorption and dilatational rheology of heat-treated soy protein at the oil-water interface: relationship to structural properties [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60, 3302-3310

[8]郑二丽. 分级分离技术制备大豆蛋白及其性质的研究[D]. 广州: 华南理工大学, 2012

[9]Wu N N, Yang X Q, Teng Z, et al. Stabilization of soybean oil body emulsions using κ, ι, λ-carrageenan at different pH values [J]. Food Research International, 2011, 44:1059-1068

[10]Hoppe A，Theimer R R. Rapeseed lipase-pH dependent specificity for native lipid body autolysis and lipolysis of artificial oil droplets [J]. Journal of Plant Physiology, 1997, 151:390-398

[11]Surh J, Decker E A，McClements D J. Influence of pH and pectin type on properties and stability of sodium-ca -seinate stabilized oil-in-water emulsions [J]. Food Hydrocolloids, 2006, 20(5):607-618

[12]GB/T 23788—2009，保健食品中大豆异黄酮的测定方法 高效液相色谱法 [S]

[13]王晓燕. 多酚对荞麦蛋白物化、营养及结构性质的影响[D]. 广州: 华南理工大学, 2010

[14]张毅方. 功能性大豆浓缩蛋白改性机理与加工技术[J]. 大豆通报, 2002(4): 21-22

[15]张梅, 周瑞宝, 马智. 功能性大豆浓缩蛋白性能测定及其应用研究[J]. 粮食与油脂, 2004(4): 21-22

[16]章莉娟. 胶体与界面化学[M]. 广州: 华南理工大学出版社, 2006: 97-100

[17]Whison S, Blaschek K，Mejia E G. Allergenic proteins in soybean: processing and reduction of P34 allergenicity [J]. Nutrition reviews, 2005, 63(2): 47-58.