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不同降解方法制备低分子量硫酸软骨素的比较

2014-01-14李燕妮

化学与生物工程 2014年3期
关键词:软骨素苹果酸草酸

李燕妮

(滨州医学院药学院,山东 烟台264003)

硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是关节软骨处蛋白多糖形成所必需的一类糖氨聚糖,广泛分布于人和一些动物如猪、牛、羊、鱼等的软骨、脐带和血管壁等组织中,其分子量为15 000~55 000。一般认为,分子量小于常规值的某个特定分子量或分子量范围的硫酸软骨素为低分子量硫酸软骨素,其不仅具有优越的药理作用和治疗效果,并且口服剂量较小[1]。

目前降解硫酸软骨素的方法主要有4类[2-3]:硫酸软骨素裂解酶降解、氧化剂降解、酸降解和碱降解。作者在此选取技术路线简单、易于工业化、生产成本低的过氧化氢降解法、草酸降解法和苹果酸降解法进行了比较研究。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

牛气管来源硫酸软骨素,自制。

草酸、苹果酸、过氧化氢及其它试剂均为市售分析纯。

Waters液相色谱仪;高速冷冻离心机(德国Heraeus公司);电热恒温水浴锅;Ne-XIIS-870型红外光谱仪。

1.2 方法

1.2.1 过氧化氢降解法

取1 000mL浓度为2%的硫酸软骨素溶液,加入Cu(OAc)2·H2O至浓度为0.002mol·L-1,在50℃下加入20mL H2O2,搅拌反应12h(期间用NaOH溶液调节pH值为7.0~8.0),加入过氧化氢酶去除未反应的H2O2,加入8BV 95%乙醇沉淀出低分子量硫酸软骨素,离心后烘干得终产品。

1.2.2 草酸降解法

取1 000mL浓度为2%的硫酸软骨素溶液,加入草酸至浓度为0.1mol·L-1,在79~81℃下搅拌反应12h,用足量碳酸钙终止反应。调节pH值为6.5,加入8BV 95%乙醇沉淀出低分子量硫酸软骨素,离心后烘干得终产品。

1.2.3 苹果酸降解法

取1 000mL浓度为2%的硫酸软骨素溶液,加入苹果酸至浓度为0.1mol·L-1,在79~81℃下搅拌12h,用足量碳酸钙终止反应。调节pH值为6.5,加入8BV 95%乙醇沉淀出低分子量硫酸软骨素,离心后烘干得终产品。

1.3 分析与测试

硫酸软骨素分子量采用《中国药典》(2010版)中高效液相色谱法测定。

红外吸收光谱测试:KBr压片,4000~400cm-1波数范围扫描。

2 结果与讨论

2.1 3种降解方法制备的低分子量硫酸软骨素的分子量及收率比较

过氧化氢降解法、草酸降解法、苹果酸降解法制备的低分子量硫酸软骨素的分子量及收率比较见表1。

表1 3种降解方法制备的低分子量硫酸软骨素的分子量及收率比较Tab.1 Comparison of the molecular weights and yields of low molecular weight CS prepared by three different degradation methods

由表1可知,反应12h后,过氧化氢降解法和草酸降解法制得的低分子量硫酸软骨素分子量较低,较原料分子量降低了86%~88%,其中大约含有6~8个硫酸软骨素双糖单位(D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖);苹果酸降解法所得产品,较原料分子量降低了55%。由表1还可知,草酸降解法和苹果酸降解法的收率明显高于过氧化氢降解法,这体现了酸法降解的优势。

2.2 3种降解方法降解硫酸软骨素的速度比较(图1)

图1 3种降解方法降解硫酸软骨素的速度比较Fig.1 Comparison of the degradation speeds of CS degraded by three different methods

由图1可知,采用过氧化氢降解法,Cu2+催化下硫酸软骨素的降解速度非常快,0.5h内即可完成降解,从时间上控制反应较为困难,不适宜制备特定分子量的低分子量硫酸软骨素。如果没有Cu2+催化,过氧化氢降解法需要很高的温度(如90℃),并且经过大约10h才能开始降解反应。草酸降解法在前3h的降解速度较快,在6h时基本完成降解。苹果酸降解法较其它两种方法反应更温和,且降解过程中分子量与时间的线性关系较好,因此,反应更易于控制,容易得到所需分子量的产品。

2.3 3种降解方法制备的低分子量硫酸软骨素的红外光谱比较(图2)

图2 3种降解方法制备的低分子量硫酸软骨素的红外光谱比较Fig.2 Comparison of the infrared spectra of low molecular weight CS prepared by three different degradation methods

硫酸软骨素主要是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖构成的双糖单位聚合体,硫酸基则与双糖单位的半乳糖在4位或6位连接形成4-硫酸软骨素或6-硫酸软骨素,因此,硫酸软骨素中含有羧基、乙酰氨基、硫酸基、糖环等基团。通过红外光谱分析,证实了这些基团在硫酸软骨素中的存在。

由图2可知,不同降解方法所得产品的红外光谱没有明显的差异,可以初步认为,3种降解方法并未对硫酸软骨素中的基团造成破坏。

3 结论

对过氧化氢降解法、草酸降解法、苹果酸降解法等3种降解方法进行比较研究表明,3种方法都可以用于制备低分子量硫酸软骨素,所得产品的分子量差别较大,其中过氧化氢降解法和草酸降解法所得产品的分子量较小;草酸降解法和苹果酸降解法所得产品的收率较高;苹果酸降解法降解过程最温和,易于控制;3种方法所得产品的红外光谱未见明显差别。

[1]ADEBOWALE A,DU J.The bioavailability and pharmacokinetics of glucosamine hydrochloride and chondroitin sulfate after oral and intravenous single dose administration in the horse[J].Biopharm Drug Dispos,2002,23(6):217-225.

[2]CHO S Y,SIM J S,TEONG C S,et al.Effects of low molecular weight chondroitin sulfate on typeⅡcollagen-induced arthritis in DBA/1Jmice[J].Biol Pharm Bull,2004,27(1):47-51.

[3]TAKEBIKO K,TADAKAZU S,YOSHIRO Y.Low molecular chondroitin sulfate and method for manufacturing the same:US,3405120A[P].1968-10-08.

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