小球藻对海水冲厕污水的净化作用及其产油性能研究

邱金泉，成 玉，张晓青，王 静，张雨山

（国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所，天津300192）

海水利用是解决沿海城市淡水供求矛盾的有效途径，采用海水冲厕可以节省30%的城市生活用水，社会效益和经济效益非常显著［1］。随着海水冲厕技术的逐步推广和应用，如何对海水冲厕后所产生的含盐污水进行经济、有效的处理，已成为当前亟待研究的课题。

小球藻（Chlorella vulgaris）作为一种高污染环境耐受性的微藻，由于具有生长快速、氮磷吸收能力强等特点，目前已被广泛应用于各类污水的处理［2－3］。近年来研究发现，小球藻体内富含相当可观的油脂类物质，可用来提取微藻油制备生物柴油［4］。因此，如能考虑将小球藻的污水处理能力与油脂积累特性进行有机结合，在净化污水水质的同时，实现清洁燃料的低成本生产，将可谓是一举多得。

作者以海水冲厕污水作为微藻培养液，考察了小球藻对海水冲厕污水中氮、磷和有机物的去除效果及其自身油脂积累特性，以期为海水冲厕污水的经济、高效、资源化处理提供可行途径。

1 实验

1.1 实验用水

模拟海水冲厕污水由生活污水和海水按7∶3的比例配制而成，其中生活污水取自市政排污口，海水取自天津塘沽近岸海域，根据实验需要添加一定浓度的葡萄糖、NH4Cl和KH2PO4，调节污水的CODCr、氨氮和总磷浓度分别为300mg·L－1、25mg·L－1和2.5 mg·L－1左右，再用1mol·L－1的NaOH溶液调pH值至7.5左右，污水的盐度在11‰左右。使用前煮沸10min灭菌，冷却。

1.2 藻种

小球藻（Chlorella vulgaris）藻种购自中国科学院水生生物研究所藻种库。以标准BG11培养液培养至对数生长期后备用。

1.3 方法

1.3.1 小球藻生长曲线的测定

取对数生长末期的小球藻液接种至培养液中，每隔72h取样，用紫外可见分光光度仪测定藻液在680nm处的吸光值（OD680），以OD680表示藻细胞的生长情况。

1.3.2 小球藻对海水冲厕污水中CODCr、氨氮、总磷的去除

取对数生长末期的小球藻液，以4 000r·min－1离心5min后，弃上清，加入15mg·L－1的NaHCO3溶液离心洗涤2次后，加入适量无菌水配成藻液。接种至装有200mL污水的500mL三角瓶中，接种藻密度约为106个·mL－1，实验设置3个平行样。接种藻液置于25℃、3000lux光照培养箱中培养，光暗比为12h∶12h，每日定时摇瓶3次。分别于开始培养后第3d、6d、9d、12d各取样15mL，经0.45μm醋酸纤维膜过滤后，测定CODCr、氨氮和总磷。

CODCr测定采用重铬酸钾法，氨氮测定采用钠氏试剂比色法，总磷测定采用钼锑抗分光光度法。

1.3.3 小球藻油脂的提取

采用改进的氯仿／甲醇法提取油脂［5］。取对数生长末期的小球藻液，离心收集藻细胞（10 000r·min－1，10min），经冷冻干燥后充分研磨成藻粉。称取100mg干藻粉，加入6mL氯仿－甲醇溶液（1∶2），振荡提取30min，再加入2mL氯仿、3.6mL水，振荡混匀后离心（6 000r·min－1，10min），取上清液。重复以上操作3次，将收集到的上清液混匀后离心（6 000r·min－1，5min），静置5min，取下层氯仿至准确称量的坩埚中，于60℃水浴中蒸干，然后转移至60℃烘箱中烘至恒质量，称量后计算油脂含量。

1.3.4 小球藻脂肪酸组成分析

室温下将提取的小球藻油脂用氢氧化钾－甲醇甲酯化后，取所得脂肪酸甲酯进行气质联用分析，以确定小球藻中脂肪酸组分及其含量。使用仪器为Bruker 436－GC与SCION SQ MS联用系统。色谱柱：HP－5MS（30m×0.25mm，0.25μm），进样量0.5μL，进样口温度250℃，载气He，柱前压265kPa，分流比10∶1，升温程序：初始温度170℃，保持2min，以10℃·min－1程序升温至200℃，保持32min。

2 结果与讨论

2.1 小球藻在海水冲厕污水中的生长状况（图1）

图1 小球藻在不同培养液中的生长曲线Fig.1 Growth curves of C.vulgarisin seawater toilet－flushing sewage and BG11medium

由图1可以看出：BG11培养液中小球藻在前12d的OD680值一直保持上升，12d时达到1.572；而海水冲厕污水中小球藻的OD680值在第9d时达到最大，为0.797，随后逐渐下降。与小球藻在BG11培养液中可以维持较高的生长水平相比，海水冲厕污水中小球藻的生长速度明显较慢，其最大生物量仅为BG11培养液中最大生物量的50%左右。

2.2 小球藻对海水冲厕污水的净化作用

小球藻对海水冲厕污水中氨氮、总磷和CODCr的去除效果见图2。

图2 小球藻对海水冲厕污水中氨氮、总磷和CODCr的去除效果Fig.2 Removal efficiency of NH＋4－N，TP and CODCrfrom seawater toilet－flusing sewage during C.vulgaris cultivation

由图2可以看出：海水冲厕污水中的氨氮和总磷在培养初期消耗很快，第3d时氨氮浓度由初始的22.6mg·L－1降至7.56mg·L－1，去除率为66.5%，而总磷浓度由初始的2.624mg·L－1降至0.224mg·L－1，去除率达到了91.5%。此后随培养时间的延长，氨氮和总磷的浓度一直保持下降趋势，至第12d时，小球藻对海水冲厕污水中氨氮和总磷的去除率分别达到87.9%和98.2%。与氨氮和总磷的去除不同，小球藻对海水冲厕污水中CODCr的净化作用非常有限，实验期间CODCr浓度下降比较缓慢，至第12d实验结束时，CODCr浓度由初始的338.7mg·L－1降至264.8mg·L－1，去除率仅为21.8%。

2.3 不同培养液中小球藻油脂产率比较

分别用BG11培养液和海水冲厕污水培养小球藻，第9d时离心收获藻体，经冷冻干燥后，测定两种不同培养液中培养出的小球藻的生物量及干藻粉中总脂含量，结果见图3。

图3 不同培养液收获的干藻生物量和总脂含量Fig.3 Biomass production and total lipid content in different culture media

由图3可以看出：用BG11培养液培养的小球藻干生物量为0.84g·L－1，细胞总脂含量为28.86%；而用海水冲厕污水培养的小球藻干生物量为0.47g·L－1，细胞总脂含量较高，达到33.03%。进一步计算可知用BG11培养液培养小球藻，每升培养液可收获微藻油脂0.2419g，而用海水冲厕污水培养小球藻，每升培养液可收获微藻油脂0.1533g，是BG11收获量的64.2%。

2.4 不同培养液中小球藻脂肪酸组成分析（表1）

表1 不同培养液中小球藻脂肪酸组成／%Tab.1 The fatty acid compositions of C.vulgarisin different culture media／%

大多数产油微藻的脂肪酸组成与油料植物相似，小球藻也不例外。由表1可以看出，BG11培养液与海水冲厕污水培养的小球藻脂肪酸主要组分有C16：0的软脂酸、C16：1的棕榈一烯酸、C18：2的亚油酸以及C18：3的亚麻酸等。与BG11中培养的小球藻相比，海水冲厕污水中培养的小球藻的脂肪酸中亚油酸比例有所上升，此外还检出了少量C14：0豆蔻酸、C17：0十七烷酸、C18：0硬脂酸、C18：1油酸等组分。总体来看，海水冲厕污水培养的小球藻的脂肪酸以C16和C18为主，符合作为生物柴油生产原料的要求。

2.5 讨论

2.5.1 海水冲厕污水中小球藻的生长及其对污染物的净化

氮、磷作为维持藻类正常生长的必需元素，在小球藻的生长、繁殖等生理过程中起着非常重要的作用。海水冲厕污水中氮、磷的浓度相比BG11培养液要低很多，养分的缺乏使得小球藻的生长速度及生物量都较低，特别是在生长的中后期（6d后），这种差距更为明显，同时培养液中的磷含量已经降到了很低的水平（图2b），限制了小球藻的增殖。除氮和磷之外，盐度也是影响小球藻正常增殖的重要因子，虽然小球藻对盐度有较强的适应性，但海水冲厕污水的盐度较高，仍可能会对小球藻的生长产生抑制作用。

小球藻对海水冲厕污水中氨氮和总磷具有较强的吸收净化能力，去除率分别达到87.9%和98.2%，特别是在培养初期，小球藻细胞能够从培养液中快速摄取氮磷等营养元素供其快速生长。藻类对有机污染物的代谢过程就是利用有机物作为碳源、能源生长的过程，与氮磷的净化去除不同，实验过程中小球藻除可以利用海水冲厕污水中的有机物外，还可以吸收空气中的CO2作为碳源进行生长和代谢，这可能是小球藻对海水冲厕污水中CODCr净化效率偏低的主要原因。

2.5.2 海水冲厕污水中小球藻的产油特性

脂肪酸甲酯是生物柴油的主要存在形式，因此，通过测定小球藻的脂肪酸总量及组分，可以评估小球藻用于生产生物柴油的潜力。实验发现小球藻能够较好地适应海水冲厕污水环境，并且收获的藻体内的总脂含量甚至还要高于BG11培养液培养的小球藻。虽然单位体积培养液获得的油脂质量与采用BG11培养液相比有所降低，但是由于海水冲厕污水作为培养基廉价易得，并且在获得清洁能源的同时可以解决环境污染问题，如能通过技术优化，提高微藻生长与产油速率，将具有良好的应用前景。

目前关于培养条件对微藻脂肪酸组成及产量影响的研究较多，学者普遍认为，营养盐特别是氮的短缺或受限能够加快微藻细胞内油脂的积累，并可能改变微藻的脂肪酸组成［6－7］。除此之外，其它因素如盐度、光照等因素的改变也会使小球藻中脂肪酸的饱和度发生变化［8－9］。与BG11中小球藻油脂的累积相比，海水冲厕污水培养的小球藻的总脂含量和脂肪酸的种类均有所增加，可认为是盐度、氮胁迫等多种因素共同作用的结果。

3 结论

（1）与BG11培养液相比，小球藻在以海水冲厕污水作为培养液时，其生长速率和生物量均明显较低。

（2）小球藻能够有效吸收海水冲厕污水中的氮、磷，培养12d时，对氨氮和总磷的去除率分别达到87.9%和98.2%，对CODCr的去除率为21.8%。

（3）采用海水冲厕污水培养出的小球藻细胞总脂含量较高，达到33.03%。海水冲厕污水中小球藻脂肪酸组成与采用BG11培养液培养的小球藻相比略有变化，但总体仍以C16和C18为主，符合作为生物柴油生产原料的要求。

总之，利用海水冲厕污水培养小球藻，可以在处理污水的同时产生微藻油脂，具有良好的发展前景和应用潜力。

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