回流法提取银杏叶总黄酮的研究

李新舟，张怀宇，许友玲

（福建师范大学闽南科技学院生命科学与化学系，福建 泉州362332）

银杏体内含有许多生物活性物质，可以抵御昆虫、细菌和真菌的侵入，银杏叶在中国作为传统的中草药已经有几千年的历史，受到国内外医学界的高度重视［1］。

早在20世纪60年代初，干银杏叶的丙酮－水（60∶40）提取物被用于治疗脑部供血不足，取得了非常显著的疗效且没有明显的副作用［2］。此后，其它国家相继致力于银杏制品的开发。现代科学研究证明，银杏叶含有200多种药用成分，其中黄酮和萜内酯是银杏叶中两类重要的生理活性物质，具有捕获自由基，抑制血小板活化因子，预防和治疗心、脑血管疾病、老年痴呆，扩张血管、降低血脂、抗衰老等药理作用［3－4］。进一步研究表明，银杏叶提取物还具有较强的抗肿瘤、抗寄生生物、抗病毒活性［5］。

近年来，银杏叶制剂与银杏叶粗提取物越来越多地用于保健食品及饮品。作者用乙醇回流法提取银杏叶总黄酮，考察料液比（g∶mL，下同）、乙醇体积分数、提取时间、提取温度等因素对银杏叶总黄酮提取率的影响，通过正交实验优化了银杏叶总黄酮提取工艺，并进一步研究了微波辅助对银杏叶总黄酮提取的影响。

1 实验

1.1 材料与试剂

银杏叶，山东临沂郯城。

槲皮素对照品；无水乙醇（AR），石油醚，5%亚硝酸钠，4%氢氧化钠，10%硝酸铝，4%盐酸，蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 银杏叶粉末的制备

将银杏叶清洗干净后于70℃烘干5～6h，然后用高速多功能粉碎机粉碎，过40目筛。取适量的银杏叶粉末用石油醚于50℃回流提取，去脂除杂，过滤，将滤渣风干，备用。

1.2.2 标准曲线的绘制

准确称取10mg槲皮素对照品，配制成0.1mg·mL－1的槲皮素标准溶液作为对照溶液。精密量取对照溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL分别置于50mL容量瓶中，加30%乙醇至10 mL，加0.5mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置5min后加0.5mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6min后加10 mL 4%氢氧化钠溶液，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，静置5～10min后测定吸光度，平行测定3次，以吸光度（A）为横坐标、槲皮素质量浓度（c）为纵坐标，绘制标准曲线［6］。

1.2.3 总黄酮含量的测定

银杏叶中总黄酮类活性成分的测定采用NaNO2－A1（NO3）3－NaOH络合－分光光度法。取0.5mL样品于25mL容量瓶中，分别加入0.5mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置5min后加0.5mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6min后加10mL 4%氢氧化钠溶液，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，放置5～10min后于510 nm波长处测定吸光度，平行测定3次，按下式计算银杏叶总黄酮提取率［［7－8］：

式中：c为总黄酮浓度，g·mL－1；V为提取液体积，mL；n为稀释倍数；m为样品质量，g。

1.2.4 单因素实验

准确称取1.0g样品粉末，置于磨口锥形瓶中，按不同的料液比加入不同体积分数乙醇、在一定温度下回流提取一定时间。抽滤，滤液离心，取上清液0.5mL，按照1.2.3方法测定吸光度，计算银杏叶总黄酮提取率。

1.2.5 正交实验设计

以单因素实验为基础设计正交实验［9］。以料液比（A）、乙醇体积分数（B）、提取时间（C）、提取温度（D）为考察因素，采用4因素3水平进行L16（34）正交实验优化银杏叶总黄酮的提取工艺［10－12］，正交实验的因素与水平见表1。

表1 正交实验的因素与水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 微波辅助提取方法

准确称取1.0g样品粉末，置于磨口锥形瓶中，按照正交实验优化的料液比加入相应体积分数的乙醇。选择5种不同微波功率进行间歇式提取15次，每次10s。测定银杏叶总黄酮的含量，考察间歇式微波辅助提取对提取率的影响。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对银杏叶总黄酮提取率的影响

准确称取银杏叶粉末1g，按1∶25、1∶35、1∶40、1∶50和1∶55的料液比加入50%乙醇，在60℃下回流提取3.0h，经纯化后测定吸光度，计算总黄酮提取率，结果见图1。

由图1可知，总黄酮提取率随着料液比的减小（即提取剂用量的增加）而增大，料液比为1∶50时，总黄酮提取率最大，进一步增加提取剂用量，总黄酮提取率反而减小。增加提取剂的用量，物料体系与提取剂体系间的浓度差加大，有利于黄酮类物质的溶出；但过多的提取剂降低了银杏叶总黄酮的浓度，使总黄酮的不稳定性增大从而容易损失，反而导致总黄酮提取率减小。

图1 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.1 The effect of solid－liquid ratio on the flavonoids extraction rate

2.1.2 乙醇体积分数对银杏叶总黄酮提取率的影响

准确称取银杏叶粉末1g，按1∶50的料液比分别加入体积分数为40%、50%、60%、70%和80%的乙醇，在60℃下回流提取3.0h，经纯化后测定吸光度，计算总黄酮提取率，结果见图2。

图2 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响Fig.2 The effect of volume fraction of ethanol on the flavonoids extraction rate

由图2可知，总黄酮提取率随着乙醇体积分数的增大而增大，乙醇体积分数为50%时，总黄酮提取率最大；当乙醇体积分数超过50%后，总黄酮提取率反而减小，至70%以后保持不变。可能的原因是高体积分数的乙醇更有利于黄酮类物质的溶解，同时高体积分数的乙醇对细胞的破坏性更强，有利于溶液渗透至物料中。然而，过高的乙醇体积分数可能增加脂溶性物质的溶出，导致总黄酮提取率减小。

2.1.3 提取时间对银杏叶总黄酮提取率的影响

准确称取银杏叶粉末1g，在水浴温度为60℃、乙醇体积分数为50%、料液比为1∶50的条件下，分别回流提取1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h，纯化后测定吸光度，计算总黄酮提取率，结果见图3。

由图3可知，总黄酮提取率随提取时间的延长而增大，提取时间为3.0h时，提取率最大，之后提取率反而减小。

2.1.4 提取温度对银杏叶总黄酮提取率的影响

准确称取银杏叶粉末1g，乙醇体积分数为50%、料液比为1∶50，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下回流提取3.0h，纯化后测定吸光度，计算总黄酮提取率，结果见图4。

图4 提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.4 The effect of extraction temperature on the flavonoids extraction rate

由图4可知，随着提取温度的升高，总黄酮提取率逐渐增大；提取温度为70℃时，提取率最大；提取温度超过70℃后，总黄酮提取率反而减小。这是因为，随着提取温度的升高，溶剂分子的运动加快，黄酮类物质溶出增加，但黄酮类物质作为一类具有抗氧化活性的物质，在高温条件下，其结构被氧化破坏的速度也会加快；同时溶出的部分蛋白质在高温下易变性与黄酮类物质发生共沉淀，导致总黄酮提取率减小。

2.2 正交实验结果与分析（表2）

由表2可以看出，提取温度对银杏叶总黄酮提取率的影响最大，其次是乙醇体积分数，料液比和提取时间的影响最小；最佳组合为A1B2C2D2，即料液比1∶45、乙醇体积分数50%、提取时间2.0h、提取温度70℃，在此条件下，银杏叶总黄酮提取率达到0.918%。

2.3 微波辅助对银杏叶总黄酮提取的影响

2.3.1 微波功率对总黄酮提取率的影响

表2 L16（34）正交实验结果与分析Tab.2 The results and analysis of L16（34）orthogonal experiment

准确称取银杏叶粉末1g，在乙醇体积分数为50%、料液比为1∶45的条件下，分别用30W、240W、400W、640W和800W5种不同的微波功率进行微波辅助提取，纯化后测定吸光度，计算总黄酮提取率，结果见图5。

图5 微波功率对总黄酮提取率的影响Fig.5 The effect of microwave power on the flavonoids extraction rate

由图5可知，随着微波功率逐步增大，总黄酮提取率相应增大，在微波功率为640W时，总黄酮提取率最大；之后，总黄酮提取率减小。可能是因为，微波的加热作用使提取液温度升高，或是微波本身对黄酮类物质的破坏。因此，选择最适微波功率为640W。

2.3.2 微波间歇提取时间对总黄酮提取率的影响

准确称取银杏叶粉末1g，在微波功率为640W、乙醇体积分数为50%、料液比为1∶45、采用间歇式提取、每次10s的条件下，分别提取10次、15次、20次、25次、30次，纯化后测定吸光度，计算总黄酮提取率，结果见图6。

由图6可知，随着微波间歇提取时间的延长，提取率逐渐增大；微波间歇提取时间为15×10s时，提取率最大，为0.91%；进一步延长提取时间，提取率快速减小，可能是由于微波产生的高温或微波直接对黄酮的破坏。与传统方法相比，在相同提取条件下，采用微波提取在几分钟内的总黄酮提取率接近传统方法3h的提取率。表明微波辅助提取能大大缩短银杏叶总黄酮的提取时间，缩短提取周期。

图6 微波间歇提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.6 The effect of microwave intermittent extraction time on the flavonoids extraction rate

3 结论

研究了乙醇回流法提取银杏叶总黄酮的工艺条件。通过单因素实验考察了料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度对银杏叶总黄酮提取率的影响，通过正交实验确定优化的提取工艺条件为：料液比1∶45（g∶mL）、乙醇体积分数50%、提取时间2.0h、提取温度70℃，在此条件下，银杏叶总黄酮提取率为0.918%。同时，本实验研究了微波辅助提取对银杏叶总黄酮提取的影响，在微波功率为640W、用50%乙醇按1∶45的料液比间歇提取15次、每次10s的条件下，银杏叶总黄酮提取率为0.91%，与传统的加热方法提取相比，大大地缩短了提取时间和提取周期。

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