降钙素基因相关肽在奥沙利铂诱导的外周神经病变大鼠模型脊髓背根神经节中的表达及作用＊

成薇婷， 许 凯

1华中科技大学同济医学院附属中西医结合医院肿瘤科，武汉 430022

2华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，武汉 430030

奥沙利铂作为新型的草酸铂，不仅是结直肠癌的一线化疗药，而且由于其肾毒性小，不良反应少，在临床上已经成为多种实体肿瘤的广谱化疗药［1］。然而其最为突出的不良反应为奥沙利铂诱导的外周神经毒性（Oxalipatin induced peripheral neuropathy，OXIPN），在很大程度上限制了临床使用，且发病机制目前尚不明确［2］。降钙素基因相关肽（calcitonin gene－related peptide，CGRP）被证实与神经病理性疼痛密切相关［3］。本研究旨在通过建立奥沙利铂诱发外周神经病变模型，了解大鼠疼痛行为学变化及其脊髓背根神经节中CGRP的表达，及CGRP在OXIPN发病中的作用机制，以期为防治OXIPN提供新的思路和途径。

1 材料与方法

1．1 动物分组与造模

健康Wistar大鼠由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，20只，8周龄，150～200g，自由摄食饮水，室温条件并普通饲料喂养，随机分为实验组（n＝10）和对照组（n＝10）。实验组使用奥沙利铂（批号：H20000686，规格：50mg／瓶，由南京制药公司提供），以5%葡萄糖溶解成20mg／L的工作液，按照临床成人常用剂量（130mg／m2）换算出大鼠的用药剂量为20mg／kg，行腹腔注射造模。对照组予以5%葡萄糖5mL腹腔注射。

1．2 一般情况观察

分别观察造模前、造模后24h、72h、7d大鼠的一般情况，包括：精神、皮毛、饮食、排便、体重等。

1．3 机械性痛阈的测定

于造模前、造模后6h、24h、72h、7d测定机械性痛阈。大鼠适应环境15min后，用Von Frey纤维机械刺激针（North Coast Medical公司，加拿大）垂直刺激大鼠后肢足底中部，使之稍成S形，持续6～8s。大鼠在刺激时间内或在移开Von Frey纤维时立即出现快速的抬足反应，记为阳性反应（身体活动所引起的抬足反应不记作阳性反应）。记录阳性反应时的刺激量，以Von Frey纤维对应的质量作为刺激的机械性痛阈。每隔5min测1次，重复3次。

1．4 冷缩足潜伏期的测定

采用Im等的方法［4］进行冷痛阈的测定。将大鼠置入铁丝笼中，适应20min后，用注射器对准大鼠的后足背的中心给予1滴丙酮酸。大鼠在丙酮酸刺激后出现抬足反射定义为阳性。用秒表记录大鼠从受刺激抬足到放下后足的间隔时间，即为冷缩足潜伏期。左右各重复3次，取平均值。

1．5 Western blot检测

于造模后6h、72h、7d获取大鼠脊髓背根神经节。具体步骤为，以0．4%戊巴比妥钠（1mL／100 g）进行腹腔麻醉后，剖胸经心脏插管，肝素钠生理盐水灌洗。迅速打开椎管，在椎间孔处截取胸腰段的背根神经节约10个，置于液氮中速存，并立即于－80℃冰箱保存备用。碾碎神经节，采用 MPERTM试剂盒提取总蛋白，应用BCA法测定蛋白浓度后，取20μg的蛋白进行SDS－PAGE电泳分离，湿转膜法转移到硝酸纤维素膜上，BSA封闭2 h，分别以兔抗鼠CGRP抗体（1∶400，美国Santa Cruz公司）4℃孵育过夜，洗膜3次，1∶1 000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温孵育1h，常规洗膜，ECL荧光显色系统暗室显像，X线片感光显影，用灰度扫描仪检测出各个条带的平均灰度值，以与GAPDH的比值代表蛋白的相对表达量。

1．6 免疫组织化学染色法

参照1．5项麻醉对照组及建模7d后大鼠，并在肝素钠灌洗后应用4%多聚甲醛200mL经心脏行全身灌注，取胸腰段的背根神经节，置于4%多聚甲醛中固定，乙醇梯度脱水，序贯二甲苯透明，再行石蜡包埋，切片机制成3．5μm的石蜡切片。按照免疫组化试剂盒（北京中杉科技公司）说明书进行SP法免疫组织化学染色（兔抗鼠CGRP抗体浓度1∶1 000，SP抗体浓度1∶400），DAB显色，苏木精复染。在光学显微镜下观察，以胞质出现棕黄色粗颗粒或弥散分布颗粒为阳性反应，在高倍镜下随机取3个视野，ImagePro Plus图像分析软件测定染色阳性的神经元平均吸光度值。

1．7 统计学方法

2 结果

2．1 一般情况

大鼠于造模成功后24h出现烦躁、撕咬、精神异常，进食及饮水明显减少，伴有大便次数增加，腹泻明显，72h及7d时体力及体重较对照组有明显下降，与OXIPN临床表现相近。毛发未见明显脱落，未见明显血便、血尿等不良反应。

2．2 机械性痛阈

与对照组相比，实验组在造模成功后6h，机械性痛阈明显降低，下降幅度以24h最为显著，72h降至低点（P＜0．05），在7d时，机械性痛阈呈低水平稳定。见表1。

表1 各组大鼠机械性痛阈的比较（g，±s，n＝10）Table 1 Comparison of mechanical threshold in rats of each group（g，±s，n＝10）

表1 各组大鼠机械性痛阈的比较（g，±s，n＝10）Table 1 Comparison of mechanical threshold in rats of each group（g，±s，n＝10）

与对照组比较，＊P＜0．05

组别 造模前 造模后6h造模后24h造模后72h造模后7d对照组14．5±2．3 13．9±3．7 13．5±4．1 14．3±2．7 13．7±3．5实验组14．6±2．7 11．6±2．2＊ 6．6±3．0＊ 3．9±1．4＊ 3．8±2．6＊

2．3 冷刺激缩足潜伏期

与对照组相比，实验组在造模6h后，冷刺激缩足潜伏期随时间延长逐渐降低（P＜0．05），并且在造模后72h降至最低，提示为冷痛觉异常（表2）。

表2 各组大鼠冷刺激缩足潜伏期的比较（s，±s，n＝10）Table 2 Comparison of cold allodynia in rats of each group（s，±s，n＝10）

表2 各组大鼠冷刺激缩足潜伏期的比较（s，±s，n＝10）Table 2 Comparison of cold allodynia in rats of each group（s，±s，n＝10）

与对照组比较，＊P＜0．05

组别 造模前 造模后6h造模后24h造模后72h造模后7d对照组4．0±0．2 3．9±0．2 3．8±0．8 4．0±0．9 3．9±0．5实验组 3．9±0．6 2．1±0．3＊ 1．2±0．5＊ 1．2±0．4＊ 1．3±0．4＊

2．4 Western blot检测CGRP表达

如图1所示，正常大鼠的脊髓背根神经节中CGRP表达水平低，注射奥沙利铂造模后6h，大鼠脊髓背根神经节中CGRP表达水平明显升高（P＜0．05），同时，随着观察时间的延长，大鼠神经受损加重，CGRP的表达量也随之明显上调，在72h时表达量较造模前明显升高［（0．90±0．06）vs．（0．07±0．01），P＜0．05］，7d时表达水平与72h时无明显差异［（0．92±0．04）vs．（0．90±0．06），P＞0．05］。Spearman等级相关分析显示，CGRP表达水平与机械性痛阈呈正相关（rs＝0．575，P＜0．05）。

图1 Western blot检测造模前后CGRP在脊髓背根神经节中的表达Fig．1 Western blot of CGRP in dorsal horn and dorsal root ganglion of rats in each group

2．5 免疫组化检测CGRP表达

切片经CGRP免疫组化染色后，可见免疫反应物呈黄棕色聚集于脊髓背根神经节细胞质中。对照组神经节中CGRP的表达量低，仅可见胞质内少许散在表达，与之形成鲜明对比的是，在实验组中，神经细胞胞质内CGRP表达丰富，在胞质内呈大颗粒状，见图2。两组间免疫组化染色阳性神经元的平均吸光度值比较，差异有统计学意义［（0．28±0．03）vs．（0．10±0．01），P＜0．05］。

图2 免疫组化染色检测脊髓背根神经节中CGRP的表达（×400）Fig．2 Immunohistochemical staining of CGRP in dorsal horn and dorsal root ganglion of rats in each group（×400）

3 讨论

随着恶性肿瘤发病率日趋增高，奥沙利铂作为新型铂类化疗药物，由于其与顺铂无交叉耐药，骨髓抑制轻微且不良反应轻等优势，目前已经成为多种恶性肿瘤的一线化疗药物［5］。然而，许多患者使用奥沙利铂后会出现外周神经病变，其急性神经毒性常表现为肢体末端感觉异常，遇冷诱发并加重；而慢性神经毒性表现常表现为剂量依赖性的慢性神经病理性痛，由于目前尚无确切的防治措施，给患者带来诸多痛苦［1］。研究提示奥沙利铂具有较高的周围神经系统亲和性［6］，因周围神经系统缺乏血－神经屏障的保护，容易受到化学药物的攻击，但其具体机制尚不明确。

CGRP是一类广泛分布于脊髓背根、三叉神经节等中枢和外周神经组织的感觉神经元中的神经肽，目前认为CGRP在疼痛的信息传递过程中发挥了极其重要的作用［7］。当躯体受到热和机械性伤害刺激时，外周传入的伤害性感受信息能促进脊髓背根神经元释放CGRP，激活CGRP受体。同时，CGRP亦可增强脊髓背根谷氨酸和P物质等疼痛递质的释放［8］，进一步参与伤害性信息的传递和脊髓水平疼痛的形成。在糖尿病外周神经炎症时，脊髓背根的CGRP的表达量与病变程度成正比［9］。在神经病理性痛模型中，当鞘内注射CGRP受体拮抗剂后，不仅机械痛觉过敏的程度被减轻，而且神经病理性痛发生的时间窗也被推迟了［10］。但是在化疗药物所诱导的外周神经病变中，CGRP的作用仍然是个未知数。

本实验，我们应用奥沙利铂腹腔注射成功建立了大鼠神经病变模型，一次性注射奥沙利铂后，大鼠在短时间内出现机械性痛阈下降，表现出机械性痛敏现象，而且这种痛觉超敏逐渐加重，并一直持续到第7天。同时，大鼠的冷疼痛过敏现象也很突出，这与临床上奥沙利铂诱导的神经病理性疼痛多因冷促发相一致。为了进一步了解OXIPN的发病机制，我们检测了造模前后脊髓背根神经节中CGRP的蛋白表达水平，检测结果提示，正常大鼠中CGRP的表达水平低，但应用奥沙利铂化疗后，脊髓中CGRP的表达水平上调，并且我们通过免疫组化原位检测进一步证实了奥沙利铂化疗前后，CGRP在脊髓背根神经节中的表达差异，提示奥沙利铂可以促进脊髓背根神经元表达并释放CGRP。并且，随着神经病理性疼痛程度的加重，CGRP的表达水平也随之升高，与周围神经病变的严重程度呈正相关。

因此，我们可以推测，CGRP在奥沙利铂诱导的周围神经病变中发挥了促进作用，抑制CGRP在脊髓背根的表达或阻断CGRP与受体结合，可能为防止和治疗OXIPN提供一条新的途径，但这仍需要进一步的干预实验证实。

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