大鼠食管静脉曲张模型中VEGF参与内皮祖细胞的调控＊

郑 凯， 项 帅， 董汉华， 王 伟， 孙以民， 梅 斌△

华中科技大学同济医学院附属同济医院1综合科2肝脏外科，武汉 430030

肝硬化门静脉高压症是我国常见病，其并发症食管静脉曲张破裂出血可危及生命。门静脉系统新生血管研究对于探明门静脉高压症的发生、发展机制有着十分重要的意义。我们的前期研究表明，在门静脉高压症大鼠食管静脉曲张模型中可见CD133阳性的内皮细胞，说明内皮祖细胞也可能参与了门脉高压症食管静脉新血管的形成［1］。但其机制尚待进一步探讨。以往的研究表明，血管内皮生长因子（VEGF）不仅可介导内皮细胞参与新生血管形成，同时也是内皮祖细胞的趋化因子之一［2－3］。本实验拟研究在门静脉高压症食管静脉曲张模型中，VEGF是否与内皮祖细胞的调控相关。

1 材料与方法

1．1 模型建立及分组

SPF级雄性Sprague－Dawley大鼠30只购自华中科技大学同济医学院实验动物学部，体重180～200g。采用门静脉缩窄法制备食管静脉曲张模型［1］，20只动物随机分为实验组10只、治疗组10只。另设假手术大鼠10只为对照组。3组大鼠均常规喂养；治疗组于术后第3周开始选择性阻断VEGF治疗，经尾静脉注射选择性VEGFR－2阻断剂SU5416，剂量为5mg／kg，每日1次，连用1周［4］。

1．2 门静脉血中VEGF浓度测定

实验组及对照组术后2周和术后4周分别剖杀大鼠各5只，留取门静脉血标本。按试剂盒手册（谷歌公司，中国），ELISA法检测门静脉血中VEGF浓度。

1．3 组织病理学检查

所有动物4周后剖杀并测门静脉压力。留取肝脏、食管组织，石蜡包埋并切片，行苏木精－伊红（HE）染色，光镜下观察肝硬化及食管静脉曲张情况。另取一部分食管胃底组织，常温下用4%多聚甲醛固定24h，石蜡包埋，5μm厚切片备用。

1．4 食管黏膜下血管内皮细胞CD133表达测定

采用DAKO公司EnVision二步法免疫组化试剂盒检测食管石蜡切片中CD133的表达情况。食管纵轴切片常规脱蜡入水，PBS洗2次，3%过氧化氢甲醇溶液室温避光封闭10min，PBS洗2次。切片浸泡在pH6的枸橼酸盐缓冲液中，用微波炉92℃～98℃热修复抗原20min，自然冷却至室温，PBS洗2次。CD133一抗1∶200稀释，4℃孵育过夜，PBS洗3次。EnVision二抗工作液，室温孵育30min，PBS洗3次；DAB染色，光镜下控制反应时间。苏木精复染，透明，中性树胶封片。

1．5 形态学观察及计量分析

上述切片用 Nikon Digital ECLIPSE C1系统（Nikon Corporation，Japan）采集图片。采用Image－Pro Plus 6．0软件系统分析图片。计数每个低倍视野下食管黏膜下层静脉数量、面积及CD133阳性内皮细胞数量、面积。计算CD133阳性内皮细胞数／食管黏膜下层静脉数百分比和CD133阳性内皮细胞面积／食管黏膜下层静脉面积百分比，以减小因静脉管腔大小差异带来的误差。

1．6 统计学方法

2 结果

2．1 大鼠食管静脉曲张形成

实验组、治疗组大鼠食管静脉曲张明显。HE切片光镜下可见实验组大鼠肝脏硬化，形成明显假小叶，纤维条索粗大。食管纵轴切面下可见食管黏膜下层静脉曲张明显。对照组大鼠肝脏未见硬化，食管黏膜下层静脉未见曲张。

2．2 门静脉血中VEGF水平

实验组术后第2周门静脉血中VEGF水平与对照组比较差异无统计学意义［（2．04±1．12ng／mL vs．（1．63±0．92）ng／mL］，术后第4周门静脉血中VEGF水平较对照组明显上调［（6．37±2．91）ng／mL vs．（1．75±0．71）ng／mL，P＜0．05］。

2．3 食管黏膜下血管内皮细胞CD133的表达

实验组、治疗组大鼠食管黏膜下血管可见CD133阳性的内皮细胞，对照组大鼠食管黏膜下血管未见CD133阳性内皮细胞（图1）。治疗组术后CD133阳性内皮细胞数／食管黏膜下层静脉数百分比和CD133阳性内皮细胞面积／食管黏膜下层静脉面积百分比均较实验组明显下降（均P＜0．05），见表1。

图1 门静脉高压症食管静脉曲张大鼠食管黏膜下血管CD133的表达（DAB染色，×400）Fig．1 CD133expression in esophageal submucosal vessels of the rat with portal hypertension and esophageal varices（DAB staining，×400）

表1 选择性阻断VEGF治疗后大鼠食管黏膜下血管CD133阳性内皮细胞比例的变化（±s，n＝10，%）Table 1 Changes of CD133positive rate of rat esophageal submucosal vascular endothelial cells after treatment of selectively blocking the VEGF－induced signaling（±s，n＝10，%）

表1 选择性阻断VEGF治疗后大鼠食管黏膜下血管CD133阳性内皮细胞比例的变化（±s，n＝10，%）Table 1 Changes of CD133positive rate of rat esophageal submucosal vascular endothelial cells after treatment of selectively blocking the VEGF－induced signaling（±s，n＝10，%）

与实验组比较，＊P＜0．05

食管黏膜下层静脉面积实验组组别 CD133阳性内皮细胞数／食管黏膜下层静脉数CD133阳性内皮细胞面积／54．2±11．4 23．7±6．7治疗组 31．7±9．0＊ 11．3±5．9＊

3 讨论

门静脉系统新生血管研究对于探明门静脉高压症的发生、发展机制有着十分重要的意义。控制肝硬化门静脉高压症发病过程中过度的血管生成，可能有助于缓解甚至消除食管胃底静脉曲张。我们的前期研究表明，门静脉高压症食管静脉曲张模型大鼠门静脉血中内皮祖细胞数量增加，且与食管黏膜下静脉密度呈正相关［1］。与此同时，在门静脉高压症食管静脉曲张模型大鼠及人体食管黏膜下血管中均可见CD133阳性的内皮细胞，而对照组无阳性发现。CD133是内皮祖细胞的表面标志物，而分化成熟的内皮细胞则不表达CD133，因此CD133可作为区分内皮祖细胞与成熟内皮细胞的标志物［5］。这些结果可初步证明：在大鼠门脉高压症食管静脉曲张模型中，有骨髓来源的内皮祖细胞被激活并释放入外周血，可能参与食管静脉新血管的形成。

然而，内皮祖细胞受哪些局部因子趋化而来，如何发挥作用，尚待进一步探讨。以往的研究表明，VEGF是内皮祖细胞的趋化因子之一［6－7］，因此，我们推测在门静脉高压症食管静脉曲张模型中，VEGF可能与内皮祖细胞的调控相关。

本研究结果显示，在大鼠门静脉高压症食管静脉曲张模型中，门静脉血中VEGF水平在2周时与对照组无显著差异，而在4周时明显上调。由于VEGF是内皮祖细胞的趋化因子之一，说明其可能促进内皮祖细胞参与部分食管曲张静脉的形成，在静脉曲张形成过程中逐步升高。

由于VEGF作用的下游因子众多，门静脉血中VEGF水平上调亦可能是作用于其它因子，如内皮细胞，参与新生血管形成［7－11］。因此，为了证明本模型中VEGF与内皮祖细胞的关系，我们选用选择性VEGFR－2阻断剂SU5416，将其用于门脉高压症食管静脉曲张模型。结果发现，选择性阻断VEGF的作用后，大鼠食管黏膜下血管CD133阳性内皮细胞比例显著下降。这间接证明了VEGF参与食管静脉曲张新生血管形成的部分机制是通过内皮祖细胞发挥作用的。

综合本研究及我们的前期研究，我们初步认为内皮祖细胞可能参与了门脉高压症食管静脉新血管的形成，部分机制是受VEGF的趋化与调控。这是食管静脉曲张形成机制的一个新线索。如果进一步探明其调控机制，则其可能成为抗血管新生治疗的新靶点。

然而，本研究仅采用了门静脉高压症食管静脉曲张形成的一种原理——门静脉缩窄（肝前型门脉高压症）而制作的大鼠模型得出上述结论。而针对门静脉高压症食管静脉曲张形成的另一种原理——肝内阻塞（肝内型门脉高压症），尚有待制作相关模型［12］后进行进一步研究。此外，内皮祖细胞参与门静脉高压症食管静脉曲张形成的进一步机制及其他调控因子，亦需要进一步探讨。

［1］ 郑凯，项帅，董汉华，等．大鼠食管静脉曲张模型食管粘膜下血管中CD133阳性内皮细胞的研究［J］．中华实验外科杂志，2014，31（9）：1102－1104．

［2］ Zheng K，Mei B．Effects of exogenous sonic hedgehog peptide on proliferation，adhesion，migration of endothelial progenitor cells from peripheral blood［J］．J Huazhong Univ Sci Technol［Med Sci］，2013，33（3）：645－648．

［3］ 周兆熊，张柏根．内皮祖细胞与缺血性疾病治疗［J］．中华实验外科杂志，2007，24（2）：252－253．

［4］ Fernandez M，Mejias M，Angermayr B，et al．Inhibition of VEGF receptor－2decreases the development of hyperdynamic splanchnic circulation and portal－systemic collateral vessels in portal hypertensive rats［J］．J Hepatol，2005，43（4）：98－103．

［5］ Bonanno G，Mariotti A，Procoli A，et al．Human cord blood CD133＋ cells immunoselected by a clinical－grade apparatus differentiate in vitro into endothelial－and cardiomyocyte－like cells［J］．Transfusion，2007，47（2）：280－289．

［6］ Bosch J，Abraldes J G，Fernandez M，et al．Hepatic endothelial dysfunction and abnormal angiogenesis：new targets in the treatment of portal hypertension［J］．J Hepatol，2010，53（2）：558－567．

［7］ Asahara T，Takahashi T，Masuda H，et al．VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrowderived endothelial progenitor cells［J］．Embo J，1999，18（6）：3964－3972．

［8］ Taniguchi E，Kin M，Torimura T，et al．Endothelial progenitor cell transplantation improves the survival following liver injury in mice［J］．Gastroenterology，2006，130（4）：521－531．

［9］ Fernandez M，Vizzutti F，Garcia－Pagan J C，et al．Anti－VEGF receptor－2monoclonal antibody prevents portal－systemic collateral vessel formation in portal hypertensive mice［J］．Gastroenterology，2004，126（3）：886－894．

［10］ Tawfeek G M，Alafifi A M，Azmy M F．Immunological indicators of morbidity in human schistosomiasis mansoni：role of vascular endothelial growth factor and anti－soluble egg antigen IgG4in disease progression［J］．J Egypt Soc Parasitol，2003，33（4）：597－614．

［11］ Moreau R．VEGF－induced angiogenesis drives collateral circulation in portal hypertension［J］．J Hepatol，2005，43（1）：6－8．

［12］ Sakadamis A K，Ballas K D，Tzioufa－Asimakopoulou V，et al．A rat model of liver cirrhosis and esophageal varices［J］．Res Exp Med（Berl），2001，200（1）：137－154．