固相萃取－气相色谱法测定人血中丙戊酸浓度的不确定度评定

彭静，宋新文，汪洋，张华年，徐华，刘炘 （武汉市儿童医院，湖北 武汉430016）

丙戊酸是儿科最常用的抗癫痫药物之一，其体内代谢过程和疗效存在较大个体差异，为临床公认的需要进行血药浓度监测的品种，有效血药浓度范围为50～100 mg·L－1。参考已发表的研究报告［1－2］，本实验建立了固相萃取－气相色谱（SPE－GC）法测定人血清中丙戊酸浓度的方法。该方法较其他方法能提高工作效率、减少试剂污染，可广泛推广。

我院开展丙戊酸血药浓度监测已有近10年历史，国内有关丙戊酸血药浓度监测的报道较多［3－5］，但未见对测定方法不确定度评定的文献，这可能是与生物样品中药物浓度的检测步骤复杂、干扰因素较多有关。本实验以国家计量技术规范、不确定度评定的相关教材及文献为理论和方法指导［6，8－10］，重点参考已发表文献［11－12］的评定步骤和内容，探讨了SPE－GC法测定人血清中丙戊酸浓度测定的不确定度评定方法。对主要影响因素进行分析评定，最终得出检测结果扩展不确定度值。可用于对丙戊酸血药浓度监测方法及测定结果准确度的评价。为更好控制血药浓度测定过程中关键步骤，开展癫痫患儿血药浓度监测提供有力依据。

1 材料

1.1 仪器 GC7890п型气相色谱仪（上海天美科学仪器有限公司）；N－2000双通道色谱数据工作站，（浙江大学智能信息工程研究所）；AB204电子分析天平（瑞士Mettler）；LDZA－0.8A 低速自动平衡台式离心机（北京医用离心机厂）。ODS－SPE 柱，规格：200 mg／支（Agela Technologies公司）。

1.2 试药 丙戊酸对照品（美国Simga公司，CAS号99－66－1）；正常空白人血清（实验室自制）；甲醇为色谱纯试剂；水为超纯水。

2 方法

2.1 色 谱 条 件［2］ATSE－54 石 英 毛 细 管 色 谱 柱（21 m×0.53 mm，1.0μm），程序升温：初始温度60℃，维持时间5 min，升温速度10 ℃·min－1，最终温度180 ℃，维持时间5 min；进样口温度130 ℃；检测器FID，温度100 ℃；进样量3μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取丙戊酸对照品29.6 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇，配成贮备液。用5 mL单标线吸量管精密量取上述贮备液于10 mL量瓶中，以甲醇稀释成2 960，1 480，740，370，185μg·mL－1丙戊酸的系列标准溶液。

2.3 血清样品预处理 采用Agela ODS－SPE固相萃取小柱对血清样品进行处理。（1）活化：用2 mL甲醇润湿小柱；（2）水洗：用2 mL 超纯水淋洗小柱；（3）加样：在含药血清中加入0.01 mL 硫酸（6 mol·mL－1），用吸量管吸取0.5 mL 含药血清上样，然后用1 mL超纯水淋洗小柱去除样本中的内源性杂质和其他相关杂质，弃去废液。（4）收集洗脱液：用吸量管吸取0.5 mL 甲醇洗脱被分析物，收集洗脱液进样检测。

2.4 样品检测与计算 分别量取“2.2”项下丙戊酸的系列标准溶液各0.1 mL，加入到空白血清1 mL中混匀，制成系列含药标准血清（质量浓度分别为16.8，33.6，67.3，134.5，269.1μg·L－1），按“2.1”项下条件进行样品的测定，以丙戊酸信号的峰面积为纵坐标（A），含药标准血清浓度为横坐标（C，μg·L－1），得直线回归方程：A＝aC ＋b。待测样品用同样的方法分析后，将样品信号的峰面积代入标准曲线，计算得到待测样品的浓度：C＝，其中a为斜率，b为截距。

3 结果

3.1 不确定度来源分析 从检测过程和数学模型分析测定丙戊酸人血中含量的不确定度来源，主要有以下几个方面：（1）涉及对照品纯度和称重；（2）标准溶液的配制：涉及逐级稀释过程（影响因素包括吸量管、量瓶允差）的影响和温度等。（3）含药血清的配制：涉及量取标准溶液及空白血清的吸量管允差和温度的影响；（4）血清药物的提取：涉及回收率问题；（5）标准曲线的拟合；（6）仪器测定：涉及重复性问题。

3.2 不确定度分量的量化

3.2.1 A 类不确定度评定 ur（1）由仪器重复测定（精密度）引入的不确定度属于A 类不确定度。平行配制低（Low，L）和高（High，H）浓度质控样品各5份（n＝5），按“2.3”项处理后进样分析，记录峰面积，按上述回归方程计算血药浓度值，为随机测定，属A 类不确定度。结果见表1。＝16.8μg·mL－1＝134.5μg·mL－1。

单次测量的实验标准差为：

观测列算术平均值的实验标准差为：

测定结果的标准不确定度为：

3.2.2 B类不确定度评定

（1）对照品称量引入的不确定度，ur（2） 对照品的相应质量由已扣除皮重的称量给出，则称量的3个不确定来源［10］：重复性、可读性（数字分辨率）以及由于天平校准产生的不确定度分量。其中天平校准本身有两个不确定度来源：灵敏度和校准函数的线性。灵敏度可忽略，因为称量是用同一架天平在很窄范围内进行。天平称量重复性引入的不确定度ur（W1），所用电子天平（d＝0.01 mg）的检定证书给出的重复性误差为±0.2 mg，按矩形分布，则：ur（W1）＝0.2／＝0.12 mg

天平的线性引入的不确定度ur（W3），所用电子天平（d＝0.01 mg）的检定证书给出的最大允差为±0.1 mg，按矩形分布，则：ur（W3）＝0.1／0.058 mg

单次称量的标准不确定度：

因称量过程采用减重法分两步，必须计算2次。

因而相对标准不确定度：

（2）配制对照品溶液时引入的不确定度，ur（3） 所用的10 mL量瓶中的溶液体积的不确定度主要来自：确定量瓶内部体积时的不确定度（校准）；量瓶和溶液温度与量瓶体积校准时的温度不同（温度）。

校准：JJG196－2006规定，20 ℃时容量允差为±0.02 mL，按三角分布换算成标准偏差为＝0.008 2 mL。

所用的5 mL 单标线吸量管体积的不确定度，与量瓶同理，包括：

校准：JJG196－2006 规定，20 ℃时的容量允差为±0.015 mL。按三角分布换算成标准偏差为0.015／＝0.006 1 mL。

不考虑重复性误差，考虑到操作次数时，配制对照品溶液引入的相对标准不确定度为：

（3）配制含药标准血清时引入的不确定度，ur（4）含药标准血清是由0.1 mL 丙戊酸标准溶液、1 mL空白血清混合而成，其不确定度主要由0.1 mL吹出式分度吸量管和1 mL单标线吸量管引起。

0.1 mLA 级吹出式分度吸量管：

校准：JJG196－2006规定，20 ℃时的容量允差为±0.002mL，按三角分布换算成标准偏差为0.002／＝0.000 82 mL。

1 mLA 级单标线吸管：

校准：JJG196－2006规定，20 ℃时的容量允差为±0.007 mL。按三角分布换算成标准偏差为0.007／＝0.002 8 mL。

（4）血清样品提取过程，ur（5） 按“2.3”项下方法平行配制低（Low，L）和中（High，H）浓度质控样品各5 份，按“2.3”项下方法处理后进样，进行GC 测定，记录峰面积，按上述回归方程计算浓度值，与配制浓度比较计算回收率，结果见表1。

表1 重复性结果回收率结果（n＝5）Tab 1 Results of repeatability and recovery（n＝5）

回收率的相对标准不确定度：

（5）线性回归过程引入的不确定度ur（6） 生物样本中药物测定时需要先建立标准曲线，然后用标准曲线计算得到未知样品的浓度，直线回归是最常用且最简单的一种，回归方程的建立对计算未知样品的浓度至关重要。按“2.4”项下方法操作，每个浓度测定2次，结果见表2。

表2 标准曲线结果Tab 2 Results of calibration curve

采用最小二乘法拟合标准曲线计算不确定度。

Yj—第i个标准溶液的第j次峰面积；Xi—第i个标准溶液的浓度；a—斜率；b—截距；P＝5（c的测量次数）；n＝10 标准溶液的测定总次数；a＝492.35；b＝2 495.3；—重复性样品中丙戊酸的平均浓度，μg·mL－1；＝104.26μg·mL－1（标准系列浓度的算术平均值）；Ci、Ai—分别为标准系列各浓度对应的丙戊酸浓度和蜂面积。

残余标准偏差为：

则其相对标准不确定度为：

3.3 合成不确定度的评定 丙戊酸浓度测定的相对标准不确定度为：

丙戊酸浓度测定的标准不确定度为：

3.4 扩展不确定度的评定 取k＝2，此时对应的置信概率为95.45%，丙戊酸浓度测定的扩展不确定度为：UL＝k×uc，L＝2×2.52＝5.04μg·mL－1，UH＝k×uc，H＝2×5.92＝11.84μg·mL－1

人血清中低浓度和中浓度质控样品中丙戊酸的浓度可分别表示为（16.8±5.04）μg·mL－1、（134.5±11.84）μg·mL－1，k＝2（95.45%的置信区间）。

4 讨论

固相萃取（SPE）是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。生物样品中药物具有浓度低、组分复杂、干扰物质多、易受环境影响等特点，采用该方法能提高工作效率、减少试剂污染，可广泛推广。

测量不确定度表征合理地赋予被测量之值的分散性，广义讲是指对测量结果正确性的可疑程度［6］。在生物分析化学领域，测量不确定度的评定越来越受到人们的重视，它与实验室的质量控制（QC）和质量保证（QA）密切相关，可作为方法学验证和水准鉴定的一部分［7］。根据计算出的不确定度分量值，绘制出各不确定度分量的统计直方图（图1），评定显著性不确定度分量，在实际操作中，可以将这些不确定度较大分量的步骤细化，找出影响因素和解决办法，为方法学建立提供科学指导，使测定结果更加准确可靠。图中显示标准曲线的拟合对低浓度样品不确定度的贡献最大，与文献报道相似［12］；而血清药物提取（回收率）及仪器测定重复性（精密度）对高浓度样品不确定度的贡献最大。分析其主要原因可能是：（1）血清药物提取时运用固相萃取柱，样品浓度过高不易完全吸附和洗脱，导致产生较大不确定度。（2）气相色谱仪器测定时由于是肉眼观察量取剂量增加不确定性，而且高浓度样品上次进样残留大，因此产生较大不确定度。结果提示，在使用SPE－GC法测定人血中药物浓度时，应加强技术人员的操作水平和技术培训、尽量使用同一规格的量器配制溶液、选择精密的量器和仪器、优化血清前处理方法、选择合适的测定浓度，高浓度样品的测定尤其要注意清洗进样器，同一样品最好同一人员测定等等。

图1 不确定度分量的统计直方图－□－高浓度；－■－低浓度Fig 1 Components of Uncertainty－□－high；－■－low

［1］ 张华年，陈渝军，刘智胜.毛细管气相色谱法测定癫痫患儿丙戊酸血药浓度［J］.中国医院药学杂志，2005，25（1）：46－48.

［2］ 张华年，陈渝军，刘智胜.程序升温毛细管气相色谱法监测丙戊酸血药浓度的价值及临床意义［J］.儿科药学杂志，2007：14－16.

［3］ 周莉华，涂琼，梅步云.HPLC 法测定人血清中丙戊酸钠的浓度［J］.中国药房，2011，22（26）：2441－2442.

［4］ 邹远高，黄英，梁茂植，等.毛细管柱气相色谱法测定血浆中的丙戊酸浓度［J］.华西药学杂志，2002，17（1）：51－52.

［5］ 吴妙莲，黄云，张慧芬.273例癫痫患儿血清丙戊酸浓度和剂量分析［J］.中国医院药学杂志，2011，31（17）：1444－1447.

［6］ 国家质量技术监督局.测量不确定度评定与表示［J］.JJF1059－1999.

［7］ Burns M.Current practice in the assessment and control of measure－ment uncertainty in bio－analytical chemistry［J］.Trac Trend Anal Chem，2004，23（5）：393.

［8］ 国家质量监督检验检疫总局.常用玻璃量器检定规程［S］.JJG196－2006.

［9］ 郭兰典.商品检测不确定度评定实例［M］.北京.中国计量出版社，2004：1－5.

［10］中国实验室国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南［M］.北京.中国计量出版社，2002：103－117.

［11］粟晓黎，李冠民，金少鸿.药品检验一般检测项目不确定度评定研究－1.B类评定［J］.药物分析杂志，2005，25（6）：699.

［12］严蓓，杨晨，李扬.HPLC 法测定人血浆中奥硝唑浓度的不确定度评定［J］.药物分析杂志，2011，31（9）：1797－1803.