决明查尔酮合成酶全长基因序列的克隆与分析

钟德馨 方袁梦梦 郭壮浩 安红强 董银松 丁若凡 王万军 廖海 周嘉裕

（西南交通大学生命科学与工程学院，成都 610031）

真核生物基因的一个基本特征是它们被一个或多个内含子所间隔，这些内含子在转录后被除去以形成具有完整读码框的mRNA。尽管真核生物基因翻译后获得的蛋白质序列中不含有内含子的信息，但是内含子的存在对基因表达有着积极的作用，能够促进基因转录、促进mRNA的翻译、参与基因的差异表达，是真核生物基因表达调控的重要元件之一。

黄酮类化合物是一类重要的植物次级代谢产物，在植物花色形成、植物育种、低抗紫外线辐射、防止病原微生物侵染中都发挥了重要作用。并且，黄酮类化合物还具有预防心血管疾病、抗癌、调节免疫、抗衰老、抗菌、抗炎等多种生物活性，是一些药用植物的主要活性成分［1，2］。查尔酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）是植物中黄酮类化合物合成途径的关键酶，是调控植物黄酮类化合物代谢的关键基因之一。CHS催化黄酮类化合物生物合成途径的第一步，丙二酸单酰CoA与香豆酰CoA缩合成查耳酮的反应［3］。目前，已从等多种植物中克隆了CHS基因，包括百合花、紫叶李、大豆、金鱼草和拟南芥等［4-7］。

虽然对植物CHS基因的克隆已有一些报道，但对相关基因的全长、外显子和内含子构成及其所属的CHS基因家族的分子进化研究得却较少。决明（Cassia tora）为豆科草本植物，其干燥成熟种子被称为决明子。决明子是一种常用的中药，有效成分主要是蒽醌类及黄酮类化合物［8］。为研究决明CHS基因的结构、进化及表达调控机制，本研究在前期已获得决明CHS基因的全长cDNA的基础上［9］，首次从决明子叶中克隆得到决明CHS基因的全长序列，分析该基因的外显子和内含子区域，并对内含子中可能的调控位点进行了预测。在此基础上，利用CHS基因构建系统进化树，展开进化分析，确定CHS基因是否能用于分析植物的遗传分化和分子进化研究问题。

1 材料与方法

1.1 材料

决明种子购自成都市中药公司，用MS培养基培养种子，取萌发的子叶作试验材料。

大肠杆菌BL21，表达载体pET28a（+）由作者所在实验室保存。测序载体pMD19-T载体（衍生自pUC-19，Ampr）、ExTaq DNA聚合酶，dNTP、氨苄青霉素、限制性内切酶、T4连接酶、DNA Marker DL2000均为大连宝生物工程有限公司产品；胰蛋白胨和酵母提取物购自OXIOID公司；琼脂糖和琼脂粉为Amersham产品；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 决明子叶基因组的制备 取决明子叶0.1 g，加液氮研磨成粉末，用北京百泰克生物有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒对决明子叶基因组进行提取，具体步骤按说明书进行。琼脂糖凝胶电泳分析DNA质量。

1.2.2 引物设计与合成 应用Primer Premier 5.0引物设计软件，根据我们在GenBank中发表的决明CHS（GenBank登录号：EU430077）基因序列在CHS基因上下游设计1对引物。该对引物理论跨幅包括决明CHS基因的开放阅读框序列1 173 bp，由上海英俊生物技术有限公司合成。引物序列，如表1。

表1 PCR扩增所用引物序列

1.2.3 决明查尔酮合成酶基因的扩增 以决明子叶基因组为模板，利用PCR从中扩增出决明CHS基因序列，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR反应体系为DNA 溶液1 μL，LA Taq酶（5 U/μL）0.3 μL，10×LA Taq Buffer 4.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.0 μL，dNTPs（各2.5 mmol/L）2.5 μL，上下游引物各（20 μmol/L）1.0 μL，ddH2O 14.2 μL。混匀后，于Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler PCR仪上进行PCR扩增。反应程序：95℃ 4 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 4 min，35个循环；72℃ 10 min，4℃，保存。

1.2.4 PCR 产物克隆与测序 采用百泰克生物公司的多功能DNA纯化回收试剂盒对PCR产物进行回收。将回收的DNA产物连接到pMD19-T载体上。将连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞，在含有50 mg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上37℃培养16 h。挑取该平板中的成熟阳性单菌落，进行菌落PCR鉴定，反应体系包含：上下游引物各1 μL；dNTP（2.5 mmol/L）2 μL；MgCl2（2.5 mmol/L）1.5 μL；10×Ex Taq PCR buffer 2.5 μL；Ex Taq酶（5 U/μL）0.2 μL；加ddH2O至25 μL，反应条件与之前相同。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。再挑取相应的单阳性菌落接种于含氨苄青霉素（50 mg/L） 的液体LB 培养基中，37℃振荡培养12 h，由三博科技有限公司进行测序。

1.2.5 CHS基因序列分析 将测序结果用在线软件Spidey（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey）进行分析，再用DNAMAN4.0软件与决明cDNA序列进行序列比对，获得内含子序列，并对内含子的酶切位点进行分析。使用在线分析软件CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrp sb.cgi）与PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分别对外显子2的保守功能结构域和内含子中的调控序列进行分析。从NCBI资源库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中选取矮牵牛（Petunia hybrida，GenBank登录号：X14591.1），百合（Lilium hybrid division，GenBank登录号：HM-622754.1），大豆（Glycine max，GenBank登录号：M-98871.1），黄芩（Scutellaria baicalensis，mRNA Gen-Bank登录号：AB008748.1，intron GenBank登录号：EU814894.1），金 荞（Fagopyrum dibotrys，GenBank登录号：GU169470.1），苦荞（Fagopyrum tataricum，GenBank登录号：HQ434624.1），拟南芥（Arabidopsis thaliana，mRNA GenBank登 录 号：NM_121396.3，全基因GenBank登录号：NM_121396.3），日本水稻（Oryza sativa，mRNA GenBank登录号：AB000801.2，全基因GenBank登录号：AC134256.4），紫叶李（Prunus cerasifera，GenBank登 录 号：DQ856583.1，内含子参考文献［5］），欧洲赤松（Pinus sylvestris，GenBank登录号：X60754.1）等植物的CHS基因，用Clustalx1.8和MEGA4软件分别对外显子和内含子构建NJ系统进化树，展开进化分析。

2 结果

2.1 基因组质量分析

由图1-A左可以看到从决明子叶中提取得到的DNA分子量在2 kb以上，无RNA和蛋白质污染。能够用于下一步的PCR扩增。

2.2 决明CHS基因的克隆

根据GenBank登录的决明CHS基因序列的保守区域设计1对特异引物，并进行PCR扩增，扩增的特异性比较好，获得了近2 000 bp的清晰条带（图1-B）。将该条带回收后，连接到pMD19-T载体上，并转化E. coli DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上培养。挑取该平板中的成熟阳性单菌落，菌落PCR鉴定阳性单菌落中含有2 000 bp的目的条带，结果见图1-C。

图1 电泳结果

2.3 生物信息学分析结果

2.3.1 决明CHS的DNA全长分析 将含有2 000 bp目的条带的单菌落进行测序，测序得到的CHS基因的起始序列为ATG，终止序列为TGA，全长为1 766 bp，含有1个长度为1 173 bp的完整开放阅读框（open reading frame）。将其提交GenBank，登录号为（JX676773）。利用Spidey软件分析获知决明CHS基因中含有1个内含子和2个外显子，其中内含子位置在188-765 bp之间，长度为578 bp（图2）。

图2 决明CHS基因外显子内含子分析

内含子5'-端碱基为GT，3'-端碱基为AG，符合GU-AG剪切规律。外显子1的位置在10-187 bp，长度为178 bp，编码59个氨基酸和半胱氨酸的第一个碱基，外显子2位于766-1 760 bp，编码半胱氨酸的第2、3个碱基及331个氨基酸。在NCBI上利用CDD在线工具分析决明外显子2编码氨基酸序列的功能结构域，结果（图3）显示，外显子2编码氨基酸序列中包含了几乎所有CHS的功能位点，包括活性位点、产物结合位点、丙二酰辅酶A结合位点和二聚体接口。

图3 外显子2保守结构域及活性位点分析

2.3.2 决明CHS的DNA内含子分析 通过DNAMAN分析获知决明CHS内含子中含有多个酶切位点，其中VspⅠ酶切位点2个、SnaBⅠ酶切位点2个及HpaⅠ、PacⅠ、SspⅠ酶切位点各1个（图4）。使用在线软件PlantCARE分析获知CHS基因的内含子中含有18个顺式调控序列，包括光诱导反应模块、增强子、水杨酸诱导反应元件和生理节奏控制表达元件等 （表2）。

图4 决明CHS内含子序列及酶切位点

2.3.3 不同物种的CHS基因内含子比对分析 利用NCBI资源库查讯到矮牵牛、百合、大豆、黄芩、金荞、苦荞、拟南芥、日本水稻、紫叶李和欧洲赤松等10种植物CHS基因全长序列。利用在线软件Spidey进行分析，发现10种植物的CHS基因中均含2个外显子和1个内含子。不同植物CHS基因内含子的位置极度保守，即位于第65位（以欧洲赤松Pinus sylvestris的PSCHS为标准）的半胱氨酸密码子内第1和2位碱基之间。但是，不同植物CHS基因的内含子序列长度变化较大，其中拟南芥CHS基因的内含子最短，只有87 bp，而日本水稻CHS基因的内含子最长，有1 655 bp（表3），表明不同植物CHS基因的内含子具有多态性，推测这种差异是由于在进化过程中，不同植物存在多样性的生活史与生活环境，导致CHS基因发生不同程度的基因重复-分歧。

根据不同植物的内含子序列，计算CHS基因的相似度，构建NJ系统进化树，结果（图5）发现进化树Bootstrap值较低，除蓼科植物金荞、苦荞外，大部分科的植物处在不同分支上，这种差异的形成可能与植物的生活史、生活环境等因素的影响有关，因此很难用于不同植物的遗传分化和分子进化研究。2.3.4 外显子2编码的氨基酸序列的系统进化树构建及Bootstrap检验 分析不同植物CHS基因编码的氨基酸序列，发现CHS基因中外显子1较短，编码约57-64个氨基酸，长度变化较大；外显子2较长，编码约340个氨基酸，没有大的插入和（或）缺失突变。由于外显子2的长度和序列上比前者要保守，因此进一步选择外显子2编码氨基酸序列构建NJ系统进化树。

表2 CHS内含子调控序列分析

表3 各物种间CHS基因内含子相似性

图5 内含子序列系统发育分析

在用NJ法构建的外显子2系统进化树（图6）大部分Bootstrap值>70，表明进化树可靠性较高，从进化树中发现金荞与苦荞等蓼科植物的进化关系更为接近，而大豆和决明等豆科植物进化关系更为接近，表明CHS外显子2编码的氨基酸序列是CHS中较为保守的部分，可作为生物遗传分化和分子进化研究中的重要依据。

图6 外显子序列系统发育分析

3 讨论与结论

虽然不同植物的CHS基因只有1个内含子，但其长度变化较大，具有明显的多态性。构建不同植物CHS基因内含子序列的系统进化树，结果发现大部分科的植物处在不同分支上，很难用来不同植物的遗传分化和分子进化研究。相比较CHS基因外显子1，外显子2的长度和序列均更加保守，因此构建外显子2编码氨基酸序列的系统进化树能够较准确反映不同植物的亲缘关系，可作为植物遗传分化和分子进化研究的重要依据。

以决明子叶为材料，获得了决明CHS基因的全长序列。该基因编码区起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，全长1 766 bp。决明CHS基因由1个内含子和2个外显子组成，其中外显子2比外显子1的序列更趋于保守，编码几乎所有功能位点。决明CHS基因的内含子长度为578 bp，符合GU-AG剪切规律，含有VspⅠ、Sna BⅠ、HpaⅠ、PacⅠ和SspⅠ酶切位点，以及光诱导反应模块、增强子、水杨酸诱导反应元件和生理节奏调控元件等18个顺式调控元件，是内含子影响基因表达调控的有力结构依据，但其具体作用机制有待进一步研究。

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