一株螯合球菌HB-4的分离及多相分类鉴定

吴刚 刘洋 李青 杜慧竟 游靖 李红 柯丛玉 张欣 余吉良 赵婷

（1.华北油田采油工程研究院，任丘 062552；2.中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100027）

螯合球菌属（Chelatococcus sp.）最早由Auling等［1］于1993年首次提出并描述，并经16S rRNA基因系统发育学分析将其归属于α-变形菌纲。螯合球菌属现包含不噬糖螯合球菌（Chelatococcus asaccharovorans）、大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis）及Chelatococcus sambhunathii三个菌种。C. asaccharovorans由Auling等［1］于1993年自蔗糖中分离获得；C. daeguensis由Yoon等［2］于2008年自印染厂废水中分离得到；C. sambhunathii由Panday等［3］于2010自温泉沉积物中分离所得。

本研究所分离与鉴定的螯合球菌HB-4，是本课题组继大邱螯合球菌HB-1之后，又一自华北油田地层水样品中分离得到的螯合球菌，该菌对原油有良好的乳化降解功能、能产生生物表面活性剂、有机酸等代谢产物、能够降低原油黏度，并经物模试验证明能够提高原油采收率（文章待发表）。

华北油田开发进入中后期，增产挖潜的难度不断加大，仅靠注水开发已很难提高油藏采收率，采用微生物驱油技术可提高原油采收率，主要利用微生物的代谢产物对原油的作用机理和微生物有效地作用于地层中的残余油，使剩余在岩石表面、小孔道中的“死原油”变得容易流动，从而提高原油采收率。本研究对HB-4的分类地位进行系统准确的鉴定，旨在为进一步了解该菌的驱油机理，充分发挥其生物学功能，提高原油开采效率奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 HB-4分离自河北任丘华北油田地层水。

1.1.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 Marker购自天为时代生物有限公司；GoldView购自北京塞百盛基因技术有限公司；溶菌酶购自Sigma公司、蛋白酶K购自Merk公司；API试剂条购自法国梅里埃公司；其它化学药品均为进口分析纯产品。

1.1.3 培养基 LB、NA及TSA培养基（成品）均购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离 取已灭菌的50 mL LB液体培养基加入50 mL油田地层水样品中，富集菌体培养48 h。采用梯度稀释法制备10-2-10-6的系列稀释液，取150 μL分别涂布到NA培养基中，37℃下培养48 h。挑单菌落转接到新鲜的NA斜面上于4℃保藏。

1.2.2 形态学观察 将菌株HB-4在NA平板上划线培养，获得单菌落，观察其菌落形态；并利用JEM-1400型透射电镜（TEM）观察其菌体形态特征。

1.2.3 生理生化鉴定 酶活性、碳源利用、糖发酵产酸和部分生化试验分别使用API ZYM、API 50CH（接种液为API AUX培养基）、API 20E及API 20NE鉴定试剂条按照使用说明进行操作。生长温度、生长pH值、耐盐性和抗生素敏感性试验参考Yoon等［2］的方法进行。

1.2.4 化学成分分析

1.2.4.1 脂肪酸的测定 脂肪酸的测定方法参照刘洋等［4］的方法进行。

1.2.4.2 极性脂的测定 极性脂的测定方法参照Liu等［5］的方法进行。

1.2.4.3 醌的测定 醌的提取及纯化参照刘洋等［4］的方法进行。取冻干菌体约150 mg，加入氯仿∶甲醇=2∶1（V/V）的溶液40 mL，在黑暗处磁力搅拌10 h左右。用滤纸过滤惧滤液。用减压旋转蒸发仪40℃-45℃减压蒸馏至干燥，弃馏液。用丙酮溶液1-2 mL重新溶解干燥物，长条状点样于GF254硅胶板（规格50×200 mm，青岛海洋化工厂分厂）上。以甲苯作展层剂展层约20 min，取出风干。在波长254 nm紫外灯下观察，在绿色荧光背景下呈暗褐色的带即为泛醌的位置（Rf=0.4）。刮下Rf=0.4的带，置于5 mL小烧杯中，用1 mL氯仿溶解，然后用细菌滤器抽滤除去硅胶，收集滤液及洗液，即得泛醌的氯仿溶液。置于4℃黑暗处保存。流动相为甲醇：异丙醇溶液，比例为4∶1，流速为1 mL/min，柱温为40℃，270 nm紫外检测。根据标准菌株泛醌组分与洗脱时间的关系（参考标准菌株），分析未知菌株。

1.2.5 分子生物学鉴定

1.2.5.1 16S rRNA基因系统发育分析 利用细菌基因组DNA提取试剂盒（Tiangen公司）提取试验菌株基因组DNA，具体步骤参见试剂盒说明书。提取的基因组DNA用0.8%的琼脂糖进行检测。以基因组DNA为模板，利用通用引物对16S rRNA基因进行扩增。引物序列为：正向引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），反向引物1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）［5］。50 μL PCR反 应体系：50 ng DNA模板，1×Taq reaction buffer，引物各20 pmol，20 μmol dNTP，1.5 U Taq酶（Ferments）。反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖进行检测。纯化后的PCR产物用ABI3700基因测序仪测序。测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。测序结果用Chromas软件参照正反序列图谱人工校对。将测序得到的结果在EzTaxon server 2.1进行比对［6］，确定与已知序列的同源关系。采用CLUSTAL W进行多序列比对［7］，并利用N-J法通过MEGA 4软件进行系统发育及分子进化分析［8］。

1.2.5.2 遗传特征测定 热变性法测定DNA的G+C含量与复性速率法测定DNA/DNA同源性参照东秀珠等［9］方法进行。参考菌株为大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis） K106T及Chelatococcus sambhunathii HT4T。

2 结果

2.1 形态学特征观察

HB-4细胞近球状，1.11 μm×1.28 μm，端生鞭毛1-2根，表面光滑，单个或成对排列；革兰氏阴性，不生孢（图1）。在TSA培养基上菌落乳白色，圆形，表面凸起，光滑，反光，半透明，边缘整齐，直径约为1.0 mm。

图1 HB-4的透射电镜细胞形态观察

2.2 生理生化特征鉴定

HB-4具有氧化酶、接触酶、酯酶（C4）、类脂酯酶（C8）、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶及萘酚-AS-BI-磷酸水解酶等酶活性；最适生长温度为37℃；能够利用24种碳源。对链霉素、氯霉素、氨苄西林、庆大霉素、四环素、卡那霉素及新霉素等抗生素敏感。HB-4生理生化特征具体结果详见表1。

2.3 化学成分分析

表2 HB-4脂肪酸组分分析

图2 HB-4脂肪酸测定气相色谱图

图3 HB-4极性脂TLC薄层层析显色图

根据MIDI微生物鉴定系统分析结果，HB-4主要脂肪酸组成（≥10%）分别为C18：1ω7c （47.01%）和C19：0cyclo ω8c（21.83%），其他组分结果见表2和图2。HB-4的极性脂主要为DPG（diphosphatidylglycerol）、PE（phosphatidylethanolamine）、PG （phosphatidylglycerol）及PC（phosphatidylcholine），见图3。HB-4的主要呼吸醌组份为Q-10（泛醌-10），约占97%，见图4。

表1 HB-4生理生化特征

图4 HB-4泛醌270 nm紫外检测结果

2.4 16S rRNA基因系统发育分析

图5 菌株HB-4 16S rRNA基因系统发育分析

利用引物27f和1492r扩增得到HB-4的16S rRNA基因序列，序列长度为1 448 bp，GenBank序列登录号为JX658137。在GenBank数据库中通过Blast方法比对，采用MEGA 4软件用N-J法构建HB-4与相关模式菌株的系统发育树（图5）。HB-4与Chelatococcus daeguensis K106T及Chelatococcus sambhunathii HT4T聚类在一个系统发育分支，序列同源性为98%以上，可确定HB-4为Chelatococcus sp.。

2.5 遗传特征测定

图6 E.coli K12 Tm值测定图

图6和图7分别为对照菌株（E.coli K12）和HB-4 Tm值的测定图。根据公式计算，基因组DNA的G+C含量为65.8 mol%，符合Chelatococcus属的G+C含量的数值范围。图8和图9为待测菌株与近缘两模式菌株同源性的测定图，经计算，HB-4同模式菌株Chelatococcus daeguensis K106T及Chelatococcus sambhunathii HT4T的DNA同源性分别为84.9%和47.2%。通过DNA/DNA（杂交）同源性测定可以初步判断HB-4应为大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis）。

图7 HB-4 Tm值测定图

图8 HB-4与K106T同源性测定图

图9 HB-4与HT4T同源性测定图

3 讨论

本研究利用细菌通用引物对HB-4的16S rRNA基因序列扩增和序列测定，并通过GenBank数据库进行分析比较和利用MEGA 4进行系统进化分析，HB-4被鉴定为螯合球菌属（Chelatococcus sp.）。以基因系统发育分析为基础，结合形态及培养特征、生理生化试验、化学成分分析及遗传特征测定结果，并综合参考螯合球菌属中现存3个菌种的相关报道［1-3］，最终确定HB-4为大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis）。

本研究所分离得到的大邱螯合球菌HB-4，是本课题组继大邱螯合球菌HB-1（文章待发表）之后，又一自华北油田地层水样品中分离得到的螯合球菌菌株，其在相关酶活性及抗生素敏感性等生理生化特征方面与HB-1存在细微的差异。目前关于螯合球菌的生物学功能的研究仅在反硝化作用方面有所报道［10］，而对其在石油原油开采领域的生物学功能及其机制机理的研究尚鲜有报道，这方面的研究有待进一步深入的开展。

微生物的形态特征是由遗传物质和生存环境等因素共同决定的，利用基于形态学、生理生化及分子生物学等技术的多相分类鉴定方法现已广泛应用于微生物分类学研究领域［4］。利用微生物多相分类鉴定技术对油田地层水HB-4鉴定至“种”水平，确定其准确的分类地位，为进一步了解和发挥这类螯合球菌的生物学功能及实现其生产利用价值奠定重要的基础。

4 结论

本研究针对自华北油田地层水中分离得到的细菌HB-4进行多相分类学鉴定，并最终将HB-4鉴定为大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis）。该菌株具有一些特殊的生理生化特征及酶学活性，具有重要的理论研究与实践应用价值。

［1］ Auling G, Busse HJ, Egli T, et al. Description of the Gram-negative, obligately aerobic, nitrilotriacetate （NTA） -utilizing bacteria as Chelatobacter heintzii, gen. nov., sp. nov., and Chelatococcus asaccharovorans, gen. nov., sp. nov ［J］. Syst Appl Microbiol, 1993, 16（1）：104-112.

［2］ Yoon JH, Kang SJ, Im WT, et al. Chelatococcus daeguensis sp. nov., isolated from waste water of a textile dye works, and emended description of the genus Chelatococcus ［J］. IJSEM, 2008, 58（9）：2224-2228.

［3］ Panday D, Das SK. Chelatococcus sambhunathii sp. nov., a moderately thermophilic alphaproteobacterium isolated from hot spring sediment ［J］. IJSEM, 2010, 60（4）：861-865.

［4］ 刘洋, 赵婷, 姚粟, 等.一株芝麻香型白酒高温大曲嗜热放线菌的分离与鉴定［J］.生物技术通报, 2012（10）：210-216.

［5］ Liu Y, Liu L, Qiu F, et al. Paenibacillus hunanensis sp. nov., isolated from rice seeds ［J］. IJSEM, 2010, 60（6）：1266-1270.

［6］ Chun J, Lee JH, Jung Y, et al. EzTaxon：a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences ［J］. IJSEM, 2007, 57（10）：2259-2261.

［7］ Thompson JD, Higgins DG, GibsonT J. CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice ［J］. Nucleic Acids Res, 1994, 22（22）：4673-4680.

［8］ Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis （MEGA） software version 4.0 ［J］. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24：1596-1599.

［9］ 东秀珠, 蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社, 2001：399-402.

［10］ 张苗, 黄少斌.高温好氧反硝化菌的分离鉴定及其反硝化性能研究［J］.环境科学, 2011, 32 （1） ：259-265.